猪苓酮A通过调节Bcl-2/Bax信号通路诱导雌激素受体阴性的乳腺癌细胞凋亡研究

目的研究猪苓酮A对雌激素受体(ER)阳性或阴性人乳腺癌细胞的凋亡作用及其可能的作用机制。方法选择2株ER阳性人乳腺癌细胞(MCF-7细胞、BT474细胞)和1株ER阴性人乳腺癌细胞(MDA-MB-453细胞),用不同浓度的猪苓酮A分别处理24 h,或以50μmol/L的猪苓酮A分别处理6、12、24、48 h后,分别采用噻唑蓝(MTT)法测定3株乳腺癌细胞的增殖情况;采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;采用Western blottig法检测与细胞凋亡密切相关的Bcl-2家族蛋白表达情况。结果猪苓酮A可以时间和剂量依赖性地抑制ER阴性MDA-MB-453细胞的增殖;而对于ER阳性MCF-7、BT474细胞增殖均无明显影响;细胞周期检测显示猪苓酮A可以使MDA-MB-453细胞的生长阻滞在G1或G2/M期;50μmol/L猪苓酮A作用于MDA-MB-453细胞24 h后,细胞出现明显凋亡,而MCF-7、BT474细胞则没有出现明显凋亡;Western blotting检测发现50μmol/L猪苓酮A处理组ER阴性MDA-MB-453细胞中促凋亡蛋白Bax、Bad表达量升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w表达量降低。结论猪苓酮A能抑制ER阴性乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制与调控Bcl-2家族蛋白的表达量有关。

HPLC法测定威喜丸中猪苓酮B、猪苓酮A、去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢茯苓酸和茯苓酸

目的建立HPLC波长切换法同时测定威喜丸中猪苓酮B、猪苓酮A、去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢茯苓酸和茯苓酸的方法。方法采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈–0.05%磷酸溶液,梯度洗脱;0～24.0 min在248 nm波长下检测猪苓酮B和猪苓酮A,24.0～50.0 min在210 nm波长下检测去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢茯苓酸和茯苓酸;体积流量1.0m L/min;柱温30℃;进样量为10μL。结果猪苓酮B、猪苓酮A、去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢茯苓酸和茯苓酸分别在5.79～115.80、1.66～33.20、3.28～65.60、7.07～141.40、1.46～29.20、0.88～17.60μg/mL与峰面积线性关系良好;平均加样回收率分别为98.75%、97.60%、98.23%、99.49%、97.10%、96.81%,RSD值分别为0.75%、1.66%、1.44%、0.90%、1.15%、1.38%。结论本方法简便、准确、重复性好,为威喜丸的质量控制提供了实验依据。

猪苓菌丝固体培养特性研究

利用固体琼脂培养基对猪苓暗培养,观测不同培养基、不同碳源、不同氮源、不同温度对猪苓生长和菌丝形态的影响,并测定猪苓在两种不同培养基上菌丝产生猪苓酮类成分的差异。结果表明:1.猪苓菌的营养需求比较简单,在只有碳源和氮源的简单培养基上均能生长;2.麦芽汁培养基、GPY培养基和GPC培养基比较适合于猪苓菌固体培养;3.玉米浆、酵母膏、奶粉、硫胺素、伴生菌提取物、蜜环菌提取物、活性白土、硅藻土、高岭土等对猪苓生长都显示出促进作用;4.固体培养猪苓菌丝能分泌黑色素;5.麦芽汁培养以及以甘油、甘露醇为碳源的培养基,都可以诱导猪苓菌丝形成菌核;6.麦芽汁培养基和甘油培养基上培养获得的菌丝体中含有猪苓酮类成分。

猪苓甾酮类化合物的HPLC含量测定及指纹图谱研究

收集中国12个省区35个猪苓样品,利用高效液相色谱技术,测定5个甾酮类化合物含量,获得指纹图谱,利用相似度评价对图谱数据进行分析。共有28个样品能获得定量分析结果,其中25个样品中猪苓酮A和B的相对含量大于70%;经相关分析,猪苓酮A和B的含量之间呈极显著正相关(r=0.955,P<0.01)。陕西省样品平均总甾酮含量以及猪苓酮A和B相对含量均最高,分别为182.70μg/g(C.V=82.4%)和92.3%(C.V=3.1%)。35个样品之间指纹图谱相似度0.412–0.943,标定了8个共有峰,指认了其中的3个色谱峰。11个陕西省样品之间指纹图谱相似度0.812–0.989,标定了17个共有峰,指认了其中的9个色谱峰。以上结果说明,猪苓酮A和B是猪苓主要甾酮类成分,对猪苓药材的质量控制有重要意义;陕西省的猪苓质量好且稳定。