猪胰蛋白酶致大鼠COPD氧化应激与动脉血气间的相关性研究

目的探讨猪胰蛋白酶(PPE)致大鼠慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary dis-ease,COPD)氧化应激与动脉血气变化的关系。方法 Wistar大鼠30只随机分为对照组(A组)、模型组(B组)和棉籽油组(C组),每组10只。B、C组大鼠气管内一次性注入PPE构建肺气肿模型,C组大鼠腹腔内注射棉籽油(1 ml/kg)。饲养30 d后处死解剖,测量大鼠肺体积,肺泡形态学,肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和测定动脉血气分析,并用统计学方法探讨氧化应激与动脉血气间的相互关系。结果 B、C组大鼠肺体积、肺泡形态学、氧化应激水平均明显大于A组(P<0.05);B、C组肺组织SOD活力和MDA含量较A组显著升高(P均<0.05)。A组动脉血氧分压(PaO2)、动脉血氧饱和度(SaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)基本正常;B、C组PaO2、SaO2明显降低,而PaCO2明显升高。肺组织SOD与PaO2呈正相关,肺组织MDA与PaO2呈负相关;肺组织SOD、MDA均与PaCO2不相关。结论用猪胰蛋白酶制作大鼠COPD模型成功,大鼠COPD氧化应激与动脉血气之间有着密切的相关性,值得在动物COPD实验造模中推广使用。

没食子酸对猪胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

以没食子酸为材料,通过考察酶质量浓度、反应体系中底物和酶及没食子酸添加顺序、不同反应时间、不同没食子酸质量浓度对猪胰α-淀粉酶、蛋白酶的活性影响,研究没食子酸对两种酶的抑制作用。结果表明,在底物质量浓度为1g/100mL、体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液37℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰α-淀粉酶活性最优条件为:α-淀粉酶质量浓度0.64mg/mL,反应时间15min,没食子酸对α-淀粉酶的最大抑制率为95.52%;在体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液40℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰蛋白酶活性的最优条件为:胰蛋白酶质量浓度0.63mg/mL,反应时间30min,没食子酸对胰蛋白酶的最大抑制率为99.24%。没食子酸对两种酶的抑制效果均随没食子酸质量浓度的增大而增强。

猪血蛋白酶解物的抗氧化功能研究

本文主要研究猪血蛋白酶解物的抗氧化作用。通过其对超氧阴离子自由基、羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力以及还原能力的测定,进行体外抗氧化试验;以溴代苯致小鼠试验性肝脏过氧化损伤为模型,进行体内抗氧化试验。结果表明,在体外抗氧化试验中,猪血蛋白酶解物对化学体系产生的自由基、羟自由基、DPPH自由基有较强清除能力,同时还具有还原能力;在体内抗氧化试验中,猪血蛋白酶解物对溴代苯所致的试验性肝脏过氧化性损伤起保护作用。由此可知猪血蛋白酶解物具有抗氧化作用。本文为广泛利用猪血蛋白资源和开发新的抗氧化补充剂提供依据。

猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的抗氧化活性研究

以猪骨蛋白酶解液和葡萄糖(或木糖)为原料,100℃水浴加热120 min以制备美拉德反应产物,采用超滤分离产物获得不同分子量范围(<1、1~5、5~10、>10 ku)的组分,研究各分离组分的体外抗氧化活性。结果表明,不同组分均具有一定的抗氧化活性,其中分子量>10 ku的组分具有较高的DPPH自由基清除能力、还原能力以及Fe^(2+)螯合活性,表明高分子量美拉德反应产物的抗氧化能力更强。葡萄糖、木糖组产物的自由基清除能力、还原能力以及Fe^(2+)螯合活性差异均不显著(P>0.05),说明还原糖结构对该研究制备的美拉德反应产物的抗氧化活性未产生明显影响。

猪骨蛋白酶解物对乳酸菌增殖作用研究

以酶水解酪蛋白、大豆蛋白胨和鱼粉蛋白胨为对照,研究了猪骨蛋白水解物对瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌增殖的影响。通过显著性分析表明,猪骨蛋白水解物对于瑞士乳杆菌有较好的增殖作用,缩短了培养的延滞期,延缓了衰退期,培养液中最高活菌数达到6.27×109cfu/mL;其对保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌增值作用比酶水解酪蛋白增殖作用略低,但差异不显著,增殖作用优于所选用的大豆蛋白胨和鱼粉蛋白胨,存在显著性差异。

湖北白猪胃蛋白酶原A基因cDNA克隆与序列分析

根据Genebank公布的J04601猪胃蛋白酶原A序列,进行了引物的设计和筛选,通过RT-PCR获得了湖北白猪的胃蛋白酶原A的cDNA序列全长,共1227bp(已提交Genebank,登录号EF108301),其具有一个长度为1158bp的读码框,编码385个氨基酸,其中包含15个氨基酸组成的信号肽,成熟的胃蛋白酶原A由370个氨基酸残基组成。与J04601比较,核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%和98.7%。经PredictProtein分析表明,核苷酸和氨基酸的改变没有造成蛋白质二级结构和功能的变化;并对胃蛋白酶原A基因密码子使用频率和mRNA的二级结构进行了分析,为其载体和宿主的选择以及基因的改造奠定了分子生物学基础。

酸法提取猪胃蛋白酶的工艺研究

目的:优化猪胃蛋白酶的酸法提取工艺。方法:在单因素试验的基础上,应用二次回归正交旋转组合设计,以猪胃蛋白酶活力为指标,建立猪胃蛋白酶活力与盐酸浸提液量、盐酸浓度、提取温度、浸提时间等因素间的数学模型。结果:回归模型较好的反应了猪胃蛋白酶活力与盐酸浸提液量、盐酸浓度、提取温度、浸提时间的关系;酸法提取工艺最佳条件为:浸提液量6.2ml、盐酸浓度1.6%、温度45℃、浸提时间59.9min,提取的猪胃蛋白酶粗酶液活力可达4751.0U/g。结论:本方法可作为天然猪胃蛋白酶的提取工艺。

毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究

利用已有的猪胃蛋白酶原A cDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得2株高表达的重组子,并研究了在不同pH、不同诱导时间、不同起始浓度和甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH7、诱导72 h、起始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46 U/mL.

猪血蛋白酶解物对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

目的:研究猪血蛋白酶解物对酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法:小鼠被随机分为空白对照组、模型对照组、药物对照组(还原性谷胱甘肽,每日以20 mg/kg mb灌胃)、猪血蛋白酶解物各剂量组(每日分别以0.83、1.70、3.33 g/kg mb灌胃),连续灌胃30 d,空白对照组和模型对照组给予等体积蒸馏水。第31天,给予体积分数50%乙醇溶液(12 m L/kg mb)建立动物急性肝损伤模型。在灌胃16 h后各组小鼠取血测定谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力;处死小鼠后取肝脏测定各项抗氧化指标,并采用组织切片分析小鼠肝损伤程度。结果:与模型对照组相比,猪血蛋白酶解物各剂量组均能降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活力及肝脏丙二醛、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6水平,提高肝脏超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力及谷胱甘肽水平,使肝脏脂肪变性程度明显减轻。结论:猪血蛋白酶解物对小鼠酒精性肝损伤具有明显保护作用,其机制可能与其抗炎、抗氧化作用有关。

猪骨蛋白酶解物对冷藏大黄鱼肌肉脂质氧化的影响

为抑制冷藏大黄鱼肌肉的脂质氧化劣变,将不同浓度(0、0.5%、1.0%和1.5%)的猪骨蛋白酶解物添加到大黄鱼肌肉中,通过观察和分析4℃冷藏条件下鱼肉感官品质及酸价、过氧化值、硫代巴比妥酸(TBA)值的变化情况,研究猪骨蛋白酶解物对冷藏大黄鱼肌肉脂质氧化的影响。结果显示,与对照组相比,添加不同浓度猪骨蛋白酶解物的各处理组鱼肉酸价、过氧化值、TBA值均显著降低(P<0.05),鱼肉感官品质显著提高(P<0.05),但不同浓度处理组之间的差异并不显著;0.5%浓度的猪骨蛋白酶解物即可有效抑制冷藏大黄鱼肌肉脂质的初级氧化产物和二级氧化产物的生成,对控制大黄鱼冷藏期间的肌肉脂质氧化具有明显效果。

山猪群体钙调蛋白酶抑制蛋白基因遗传变异研究

目的:研究猪钙调蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在山猪群体的遗传变异情况,为山猪肉质研究奠定基础。方法:应用PCR-SSCP技术和测序方法检测山猪及其杂种猪CAST基因的遗传多态性,并与其他品种猪相应序列进行比较。结果:用pCT1引物在山猪及其杂种群体中检测到2个多态位点(A,B),用pCT2引物检测到3个多态位点(C,D,E);序列分析表明,C和E位点共同拥有6处变异。结论:通过与其他猪品种比较,发现山猪的CASTMsp基因型分布与梅山猪的基因型分布完全一样,而与国外品种猪的基因型分布差异明显。

改良的猪胰弹性蛋白酶气压灌注法建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型

目的探讨用一种新型的猪胰弹性蛋白酶气压灌注法建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型。方法 40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为常规模型组(n=15),改良模型组(n=15),改良对照组(n=10)。常规模型组使用猪胰弹性蛋白酶利用水压逆行灌注腹主动脉5min,改良模型组使用猪胰弹性蛋白酶利用气压顺行灌注腹主动脉5min,而改良对照组使用生理盐水气压下顺行灌注5min,14d后,收取腹主动脉标本,测量血管直径,并行EVG染色,进行统计学及组织学评估。结果与常规模型组相比,改良模型组的成瘤率明显增高(P<0.05),血管直径也明显增大[(1.765±0.095)vs.(1.440±0.091)mm,P<0.05],而实验鼠存活率亦明显升高(100%vs.80%)。改良模型组EVG染色显示弹力纤维断裂、降解,符合动脉瘤的病理学特征。结论通过改良设计的新型猪胰弹性蛋白酶气压灌注法高效建立了小鼠腹主动脉瘤模型。

光谱法研究变性剂诱导的猪胃蛋白酶和牛血清蛋白折叠中间态的分布和过渡

利用紫外光谱和荧光光谱分别测定了变性剂诱导的猪胃蛋白酶和牛血清蛋白的残余活性,并根据它们的两个特征展开参数定量描述了猪胃蛋白酶和牛血清蛋白天然态、折叠中间态和完全展开态随变性液中变性剂浓度的分布和过渡。结果表明,在盐酸胍诱导的猪胃蛋白酶"三态"去折叠过程中,当盐酸胍浓度约为1.5mol/L时,折叠中间态的浓度达到最大,约占溶液中总猪胃蛋白酶的12%;在脲诱导的牛血清蛋白"三态"去折叠过程中,当脲浓度约为2.0mol/L时,折叠中间态的浓度达到最大,约占溶液中总牛血清蛋白的41%;而在盐酸胍诱导的牛血清蛋白"四态"去折叠过程中,当盐酸胍浓度约为0.4mol/L、1.2mol/L时,第一和第二折叠中间态浓度分别达到最大,约占溶液中总牛血清蛋白的20%和70%。

猪胰弹力蛋白酶血管外消化法制作兔颈总动脉梭形动脉瘤

目的：探讨使用颈总动脉外膜消化法制作兔颈总动脉梭形动脉瘤的可行性和有效性。方法将16只新西兰大白兔按随机数字表法分为两组。实验组12只,使用猪胰弹力蛋白酶80~400 U孵育消化右侧颈总动脉起始点远端2~4 cm段。造模后1周行静脉血管造影,测量颈总动脉梭形膨大的宽度；取梭形扩张血管行苏木素-伊红（ HE）染色及扫描电镜观察血管病理学变化。对照组取4只新西兰大白兔,使用等渗盐水孵育颈总动脉,1周后采用同样方法观察颈总动脉管腔及内膜变化。结果实验组12只新西兰大白兔在颈总动脉外膜消化后,血管造影显示10只模型兔颈总动脉管腔呈梭形扩大,梭形动脉最宽处直径为（3．70±0．32） mm,2只出现颈总动脉闭塞,较对照组右侧颈总动脉血管直径[（1．80±0．16） mm]明显增粗（P〈0．01）；HE染色显示实验组兔右侧颈总动脉消化段管腔增宽,外膜及中膜减少；扫描电镜显示实验组兔颈动脉内膜炎性损伤及血栓附着。结论使用猪胰弹力蛋白酶消化颈总动脉外膜可以使兔颈总动脉呈梭形扩张,并造成颈动脉内膜损伤。使用此方法能够有效制作出梭形动脉瘤模型,具有一定的可行性。

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A(pepsinogen)基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了猪胃蛋白酶原A基因,该基因全长1 240 bp,将该基因克隆到表达载体pPIC3.5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒,通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115,检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达.

双功能化无机介孔材料对猪胰蛋白酶催化性能的影响

通过在SBA-15介孔材料表面引入带有不同官能团及不同亲疏水性质的修饰剂(-SH,-Cl,-NH_2,-C_1,-C_3,-C_8及-C_(16)),改善介孔材料与猪胰蛋白酶的结合力及蛋白酶所处微环境,从而提高酶固定化效率,活性及其稳定性。结果表明,官能团修饰后载体固定化酶PT-NH2/C8-SBA活性达到255 U/mg胰蛋白,较之未修饰载体固定化酶PT-SBA活性(195 U/mg胰蛋白)有大幅度的提高;并且重复使用五次及在室温下保持5 d后,PT-NH_2/C_8-SBA活力仍然能保持初始活力的85%及81%。而PT-SBA仅仅保留了初始活性的51%及67%。固定化酶的酶学性质和催化反应动力学研究表明,底物与固定化酶PT-NH_2/C_8-SBA具有更好的亲和力,固定化酶PT-NH_2/C_8-SBA有较高的活力和稳定性。

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.

乙醇辅助盐析分离猪胃蛋白酶

为确定盐析分离猪胃蛋白酶的最佳分离工艺条件,以猪胃粘膜为原料,经盐酸浸提,通过乙醇辅助盐析对照试验、透析冷冻干燥得猪胃蛋白酶比活力为102927.5U·g-1,酶经fSephadex-G75洗脱得到单一蛋白峰,再经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,表现为单一蛋白,酶的亚基相对分子质量约为35ku。

聚乙二醇沉淀猪胰蛋白酶的研究

研究了从猪胰脏中用聚乙二醇(PEG)分离提取胰蛋白酶的条件。采用单因素实验考查了聚乙二醇分子量、聚乙二醇浓度、pH值和提取时间对胰蛋白酶活力的影响,并通过正交实验对提取工艺条件进行优化,在0.25g/mL聚乙二醇6000,pH7.5,4℃提取3 h条件下,胰蛋白酶酶活力达到1600 U/mL以上,比传统的盐析法提取率高,并且操作简单,是一种比较有效的分离猪胰蛋白酶的方法。

猪胃蛋白酶制备新鲜干酪及其特性分析

以新鲜猪胃黏膜为原料,提取并初步纯化得到猪胃蛋白酶(PPe),分别从化学成分、产率、质构3方面研究PPe在新鲜干酪中的作用效果。结果表明:在化学成分上,PPe优于微生物凝乳酶,尤其中剂量效果最好;在质构特性方面,PPe制得的干酪比微生物凝乳酶及市售猪胃蛋白酶制得的干酪更接近皱胃酶(CR)制得的干酪,且高剂量PPe制得的干酪硬度、弹性、内聚性、胶黏性和咀嚼性均与小牛皱胃酶制得的干酪无显著差异(P>0.05)。PPe优于微生物凝乳酶及市售猪胃蛋白酶,可以作为小牛皱胃酶的替代物应用于新鲜干酪的生产。