Wnt/β-catenin/VEGF通路在副猪嗜血杆菌引起猪内皮细胞损伤中的作用

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起猪渗出性炎症的过程中血管内皮屏障的变化情况,以HPS感染原代猪血管内皮细胞,通过Western blot和荧光定量PCR检测HPS对Wnt/β-catenin通路及其下游靶基因表达的影响,并通过间接免疫荧光和跨内皮电阻测定检测细胞间黏附连接结构的改变。结果显示:HPS感染激活猪内皮细胞中的Wnt/β-catenin信号通路,促使胞质中的β-catenin蛋白发生核转位,导致胞膜处由β-catenin和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)构成的黏附连接结构被破坏,细胞通透性增加。抑制Wnt/β-catenin通路下游血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达,可以明显抑制β-catenin的核转位,显著恢复内皮细胞间β-catenin和VE-cadherin构成的黏附连接结构,恢复内皮细胞通透性。以上研究结果表明,HPS通过激活猪内皮细胞中Wnt/β-catenin通路,破坏细胞间黏附连接,增加内皮细胞通透性;同时,Wnt/β-catenin通路下游VEGF基因通过正反馈调节效应放大了HPS感染引起的Wnt/β-catenin信号通路的激活效应和细胞结构的损伤。

黄芩苷抑制Panx-1和P2X7的激活减轻副猪嗜血杆菌病血管内皮细胞损伤

采用细胞培养模型,通过GPS诱导后猪髋主动脉血管内皮细胞(PIVECs),探讨Panx-1和P2X7调控副猪嗜血杆菌损伤血管内皮细胞功能的分子机制以及黄芩苷干预作用。分别采用实时荧光定量PCR和Western blot测定Panx-1、P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白质表达量。结果表明,GPS感染PIVECs后,Panx-1、P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18基因的mRNA表达量均极显著升高,大部分浓度的黄芩苷处理能极显著下调以上基因的表达量。Western blot测定表明,P2X7、NLRP3、IL-1β和IL-18的蛋白质表达量极显著升高,大部分浓度的黄芩苷处理能显著、极显著下调以上蛋白质的表达量。黄芩苷可以通过抑制Panx-1和P2X7的激活从而减轻副猪嗜血杆菌病血管内皮细胞的损伤,为控制副猪嗜血杆菌在临床上的感染提供新思路和新方法。

人、猪、鼠血管内皮及平滑肌细胞培养与纯化方法的改进

对培养和纯化猪主动脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、猪和鼠主动脉平滑肌细胞的方法进行改进。对其鉴定方法进行了讨论。用胶原酶或胰酶消化法 ,或机械法分别从猪主动脉、人脐静脉、鼠主动脉获得内皮细胞和平滑肌细胞进行培养 ,用光学相差显微镜、免疫组化的方法进行鉴定。结果显示 ,相差显微镜观察 :人脐静脉内皮细胞接种后 2～ 3小时贴壁 ,继而铺开生长。在视野内形成散在细胞团。细胞呈铺路石样排列的单层。随着传代次数增多 ,可见核分裂、双核及多核。猪血管内皮细胞呈鹅卵石样 ,多角形 ,生长分裂旺盛时可见两个或多个核。猪和鼠的平滑肌细胞在相差显微镜下外观为长梭形 ,细胞生长致密时排列成束 ,相互平行 ,并且重叠生长 ,表现为典型的“波峰”与“浪谷”状。猪血管内皮细胞 Di I- Ac- L DL 染色 ,在荧光显微镜下显示特征性的黄绿色荧光。人 因子抗原免疫组化检测人脐静脉内皮细胞 ,显微镜下可见核周胞浆呈现阳性反应。免疫组织化学法进行平滑肌细胞 α-肌动蛋白染色 ,显微镜下见细胞浆内着色。本文介绍的培养及纯化猪血管内皮细胞、猪平滑肌细胞。

应用端粒酶逆转录酶基因使猪血管内皮细胞永生化的初步研究

为寻求使猪主动脉血管内皮细胞增殖寿命延长的方法,本试验将含有人类端粒酶催化亚基端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT通过脂质体介导法导入猪主动脉血管内皮细胞(Porcine arterial endothelial cell,PAEC)。对转染后的血管内皮细胞进行Ⅷ因子和CD34鉴定,利用PCR-ELISA方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨了转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后的细胞Ⅷ因子和CD34均呈阳性,证明转染后细胞仍表达血管内皮细胞的特异性蛋白;导入hTERT后,细胞有较高的端粒酶活性,增殖寿命较对照细胞延长了20代。表明hTERT导入细胞能重建细胞端粒酶活性,从而延长细胞在体外培养的寿命。

猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选

本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重组载体与microRNA的抑制物,最后通过发光检测仪测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了CSFV5′非翻译区(373 bp)和3′非翻译区(252 bp)的报告基因载体,并合成了4条预测出的microRNA(ssc-mi R-let7c、ssc-mi R-106a、ssc-mi R-18、ssc-mi R-139)的抑制物,共转染后发光检测仪检测到荧光素酶的活性被不同程度抑制。本研究发现microRNA作用位点主要在CSFV的3′-UTR,而且以上4种microRNA都对CSFV3′-UTR有不同程度的抑制作用,其中ssc-mi R-18的抑制作用比较明显。

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。

猪血管内皮细胞体外培养方法的建立

实验研究了猪血管内皮细胞体外培养方法并对培养的细胞进行了鉴定。获得了传代培养的猪血管内皮细胞。结果表明:用Ⅰ型胶原酶和胰酶消化分离,均可获得接种量的原代培养物,但Ⅰ型胶原酶消化效果更好;原代或早期传代培养物中有时混入的成纤维细胞可用柠檬酸胰酶有效清除。在不用贴附基质和内皮细胞生长因子(ECGF)的条件下,向生长液中加入胰岛素可成功的培养内皮细胞。该细胞在体外培养时贴壁生长,单层细胞呈"铺路石"状排列,细胞间存在接触抑制;第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性,证明培养的细胞为血管内皮细胞。

高速投射物所致创伤猪血清对血管内皮细胞的影响

高速投射物所致创伤猪血清对血管内皮细胞的影响６３００４２第三军医大学野战外科研究所李开龙，赖西南，练伟坤，刘荫秋（指导）本实验通过观察伤后不同时间点猪血清对培养猪主动脉内皮细胞（ＶＥＣ）结构和功能的影响，旨在进一步揭示高速投射物伤后血液中神经体液因子...

猪松弛素对人肺微血管内皮细胞产生一氧化氮的影响

目的观察猪松弛素(pRLX)对人肺微血管内皮细胞(HMVECs)产生一氧化氮(NO)的影响,探讨这种效应的可能机制。方法Western blotting检测不同浓度pRLX作用下HMVECs诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)和原生型一氧化氮合成酶(cNOS)蛋白表达;Griess法检测不同浓度pRLX分别在不同的作用时间下对HMVECs NO产量的影响;Griess法检测选择性iNOS抑制剂氨基胍、非选择性NOS抑制剂L-单甲基精氨酸和NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸对pRLX刺激HMVECs产生NO效应的影响。结果pRLX促进HMVECs iNOS蛋白表达,但对cNOS表达影响不显著;pRLX呈浓度依赖性促进HMVECs NO产量,但24 h至96 h范围内各pRLX作用时间组之间NO产量无显著差异;氨基胍、L-单甲基精氨酸和吡咯烷二硫氨基甲酸均能阻断pRLX促进HMVECs产生NO的效应。结论pRLX促进HMVECs iNOS表达和NO生成。

猪瘟病毒石门株E2基因在永生化猪血管内皮细胞的表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因定向插入逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2。将pBABE-puro-E2和辅助质粒pVSV-G经磷酸钙共沉淀法转染293GP包装细胞系,将其包装为完整的逆转录病毒假病毒;用包装好的假病毒在polybrene的介导下转导第30代的永生化猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并将筛选出的阳性细胞腹腔免疫BALB/c小鼠。RT-PCR检测SUVEC内的E2基因,用间接免疫荧光试验鉴定E2蛋白在SUVEC上的表达,间接ELISA试验检测小鼠血清抗体。结果表明,CSFVE2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达,而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体。

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。

人NK细胞对猪/人血管内皮细胞的差异粘附

采用51Cr标记法和3H TdR摄入法研究了人外周血NK细胞 (PBNK)和人NK细胞系———NK92对猪主动脉内皮细胞 (PAEC)和人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的粘附作用。结果表明 ,NK92和PBNK对PAEC的粘附率显著高于对HUVEC的粘附率 ;rhTNF α预刺激PAEC/HUVEC后 ,PBNK的粘附率呈现TNF α剂量依赖性的增高 ;rhIFN γ预刺激NK92 /PBNK后 ,两者对PAEC粘附率的增幅均高于对HUVEC的增幅 ;CD11a (LFA 1)单抗可以不同程度地抑制PBNK对静息和TNF α激活的PAEC的粘附作用。这些结果提示 。

经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

【目的】研究猪瘟病毒（CSFV）E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%-99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。

内皮源IL-8对PCV2感染猪血管内皮细胞迁移的影响

本研究通过建立PIEC划痕创伤模型,设细胞对照组、接毒组、IL-8抗体处理细胞对照组和IL-8抗体处理接毒组,观察内皮细胞的迁移率,同时用ELISA检测细胞上清中内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF和NO的含量,以探索猪圆环病毒2型(PCV2)对猪血管内皮细胞迁移方面的影响因素。结果显示,接毒组细胞迁移率、上清中bFGF、VEGF含量显著高于对照组;抗体处理细胞对照组上清中bFGF、VEGF、NO含量显著低于细胞对照组;抗体处理对照组和抗体处理接毒组迁移率、上清中bFGF、VEGF、NO显著低于接毒组。以上结果表明,PCV2感染诱导分泌的IL-8可调控内皮细胞bFGF、VEGF、NO分泌而影响猪髋动脉内皮细胞的迁移。

血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的血管内皮因子(VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0ng/mLVEGF对照组、5ng/mLVEGF试验组Ⅰ、50ng/mLVEGF试验组Ⅱ、500ng/mLVEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明:(1)试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;(2)成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;(3)成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。说明5ng/mL或50ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。

PCV2感染猪血管内皮细胞相关免疫调节分子的表达变化

将猪圆环病毒2型(PCV2)接种猪血管内皮细胞(VEC),于接种后不同时间收集细胞及上清,利用实时荧光定量PCR和ELISA技术分析VEC相关免疫调节分子表达变化。与对照组相比,PCV2感染后血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的mRNA水平变化趋势基本一致,VEGF和M-CSF在感染后12h显著上调,IL-6与M-CSF在48h显著下调;MCP-1和IL-8在感染后4h和48h均显著上调,且IL-8在24h时上调显著,72h下调显著。蛋白水平上,VEGF在4h显著下降,24h显著增高;IL-8在4h和24h显著上升。以上结果表明,PCV2体外感染导致VEC免疫调节功能分子表达异常,其炎性趋化、黏附能力以及对树突状细胞(DC)的分化、成熟等免疫调节功能可能受到影响。

猪圆环病毒2型体外刺激猪髋动脉血管内皮细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

通过PCV2病毒感染猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)后炎症相关细胞因子mRNA转录水平变化,探讨PCV2感染诱导炎症产生的免疫机制。将PCV2病毒体外接种PIEC,感染不同时间后,收集样品,荧光定量PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-8及IL-18 mRNA转录水平的变化。结果显示,PCV2感染PIEC后,对促炎症细胞因子IL-1β、IL-18及趋化因子IL-8主要起上调表达作用。由此推测细胞因子在体内的综合效应会导致PCV2感染早期机体产生过度炎症反应,并趋化中性粒细胞,引发机体免疫抑制,影响机体特异性免疫应答的正常运转,为PCVD的发病创造条件。

异种血清对猪血管内皮细胞适应模型的影响

目的:观察胎牛血清对PAEC适应模型的影响。方法:以猪自体血清原代培养PAEC并传代,接种于96孔板后分别以5%正常人血清(NHS组)、胎牛血清(FCS组)和补体灭活的胎牛血清(FCS+C组)诱导6d,加入25%正常人血清,以MTT比色法检测细胞的存活率,并以免疫组化的方法观察各组HO-1的表达情况。结果:NHS组和FCS+C组细胞存活率均升高,同对照组相比差异显著,两组间亦有差异,HO-1表达均增加。FCS组与对照组无差异。结论:质量不佳的胎牛血清或补体灭活不充分的胎牛血清会干扰PAEC适应模型的诱导。