猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞,筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果:消化法分离的细胞约1周长成单层,组织块贴壁法约2周长满单层,但活力更高;PRCs主要形态为长梭形和大理石样,呈现为2种形态细胞混合生长;差速消化法纯化细胞后,经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞;细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上,本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基,该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变,为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

微囊化猪视网膜色素上皮细胞移植治疗帕金森病的实验研究(英文)

目的研究微囊化后的猪视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)对帕金森病大鼠模型的移植疗效。方法原代培养RPE 并传代,高效液相色谱法测定培养液上清中多巴胺(dopamine, DA)和高香草酸(homovanillic acid, HVA)的含量,ELISA法检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor, GDNF)的含量。用高压静电成囊装置制备海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化细胞。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)毁损内侧前脑束 (medial fore-brain bundle,MFB)建立 SD 大鼠帕金森病模型。立体定向移植 RPE+ 微囊,检验旋转实验、免疫组化和脑内生化的变化。结果 RPE 培养上清液中DA、HVA、BDNF、GDNF 的含量稳定,微囊化后细胞长期存活,活性没有明显变化。6-OHDA毁损MFB建立大鼠帕金森病模型的成模率为83%。移植微囊化的RPE后有效率为33%。结论猪 RPE 体外培养生长旺盛,持续分泌 DA、BDNF 和 GNDF,微囊化不影响其分泌功能。RPE 移植对帕金森病大鼠有一定的治疗作用。

蓝光诱导猪视网膜色素上皮细胞复制衰老的实验研究

目的观察蓝光对猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞复制衰老过程中衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence associated-beta-galactosidae,SA-β-Gal)的影响。方法将第3～6代猪 RPE 细胞置于自制蓝光发光二极管(light emitting diode,LED)光源下,波长450～500 nm,1h/d;细胞表面水平光照强度分别为(500±100)lux、(1000±200)lux、(2000±500)lux,光照时细胞水平面的温度变化为36.5～37.5℃;对照组用黑纸完全包裹培养瓶。将各组细胞消化后接种于24孔板和96孔板培养24 h,进行 SA-β-Gal 活性的检测和 MTT 法检测细胞增殖情况。结果随光照强度和传代次数增加,细胞内出现蓝色颗粒的阳性细胞数目逐渐增多,SA-β-Gal活性增高,除高强度与中强度光照组、第4代和第5代之间相比差别没有统计学意义(P>0.05)外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义(P<0.05);通过 MTT 法检测,细胞的增殖能力随光照强度和传代次数增加而降低,除中强度与低强度光照组相比差别没有统计学意义(P>0.05)外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论蓝光可以诱导体外培养猪 RPE 细胞复制衰老,并且光照强度增加可以促进细胞复制衰老。

光照对视网膜色素上皮细胞分泌多巴胺功能的影响

目的:检测体外培养的猪视网膜色素上皮(RPE)细胞多巴胺(DA)分泌水平,观察光照和多次传代对其分泌DA功能的影响。方法:酶消化法获得猪RPE细胞。纯化并鉴定后观察原代RPE细胞的生长曲线。第2代细胞分为正常培养组、光照组和遮光组进行培养。高效液相色谱法检测DA量。ELISA法测定其分泌脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经生长因子(GDNF)的水平。结果:免疫细胞化学鉴定显示原代RPE细胞纯度高,生长曲线显示第1～4天为其指数生长期。DA分泌在传代后第2天开始检测到,第4天达高峰以后缓慢下降并趋稳定。多次传代后DA分泌量无显著变化。光照刺激24h后DA分泌增加,HVA、GDNF和BDNF变化不显著。结论:猪RPE细胞体外生长旺盛,易于纯化和传代。能够持续分泌DA且不受多次传代的影响。光照刺激可以使RPE分泌DA增加。