猪圆环病毒2型感染性克隆构建

基于PCV2滚环复制原理,在分析PCV2不同基因亚型代表毒株基因组结构和序列的基础上,设计2对引物用于PCR扩增PCV2基因组序列。以从收集到的疑似PCV2感染的10份猪血清样品中提取的DNA为模板,用设计的引物扩增目的片段,并进行测序分析,1株为PCV2a型,4株为PCV2b型,5株为PCV2d型。每种基因型毒株中各选取一个样本,利用上述2对引物进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pEASY-Blunt simple载体中,通过双酶切连接2个PCR片段,构建含有约1500 bp重叠序列的PCV2基因组的质粒。通过脂质体转染法将含PCV2全基因组的质粒转染至PK-15细胞进行病毒拯救,经PCR和IFA两种方法验证,证明成功拯救出3个基因型的PCV2毒株。通过对PCV2全基因组结构及序列分析,该方法同样适用于PCV2g、PCV2h基因型病毒的感染性克隆构建。本研究建立了一种基于反向遗传学技术的PCV2感染性克隆的构建方法,为开展PCV2的病原学研究提供了技术支持。

猪输血性传播病毒2型全基因组的克隆与序列分析

为了监测猪输血性传播病毒2型(TTV2)的疫源和进化情况,为进一步研究TTV2的形态结构、遗传变异和基因功能奠定生物学基础,参照国外发表的猪输血性传播病毒(TTV)全基因组核苷酸序列(GU456386.1),设计3对特异性引物,采用巢式PCR对采自四川省的疑似猪输血性传播病毒感染的血清样品进行TTV全基因组的克隆、测序和拼接,并对其进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,该基因组全长2 802bp,与国内外参考株同源性介于87%～96%之间,ORF1的同源性介于81%～95%;ORF2的同源性较高,介于93%～99%之间。系统进化树分析表明,该分离株与美国株PTTV2c-VA的同源性高达96%。结果表明,该毒株为TTV2,与国内外参考株有一定的相似性。

猪输血传播病毒2型ORF1基因的原核表达及条件优化

为了克隆猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达猪TTV2 ORF1蛋白,并对其表达条件进行优化。利用普通PCR从猪TTV2阳性样本中扩增出TTV2 ORF1基因,利用分子克隆的方法将猪TTV2 ORF1基因克隆到原核表达载体pcoldI上,构建表达载体pcold-ORF1,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF1融合蛋白。并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定了pcold-ORF1重组蛋白表达的最佳表达条件。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白在BL21中高效表达,以包涵体形式表达为主,分子质量约为39 kDa。蛋白表达量随诱导时间增加而有所增加,在15℃时表达量最高,而IPTG浓度对蛋白的表达量没有显著影响。Western Blotting结果表明,重组蛋白与猪TTV2阳性血清特异性反应,具有很好的免疫原性。成功获得TTV2-ORF1基因,构建了原核表达载体并获得高效表达,为TTV的ELISA检测方法的建立提供抗原。且重组蛋白在15℃条件下,加入0.2 mmol/L浓度的IPTG,诱导24 h,表达条件最佳。

猪圆环病毒2型分离鉴定与致病性研究

为了解猪圆环病毒2型(PCV-2)的致病性,采集疑似猪圆环病毒2型感染的病死猪的淋巴结和脾脏等病料组织5份,采用PCR方法、病毒的分离培养、间接免疫荧光试验等方法对PCV-2进行分离鉴定,并采用动物人工感染试验验证分离毒株的致病性。结果表明:通过采用PCR方法、病毒的分离培养、间接免疫荧光试验等方法分离得到了1株PCV-2分离毒株,命名为HLC1株,其TCID_(50)为4.12×10^(7) TCID_(50)/0.1 mL,分离的PCV-2毒株HLC1株对28日龄仔猪具有致病性。研究结果可为猪圆环病毒2型的综合防控提供参考依据。

猪圆环病毒2型HZ0201株分子克隆的感染性分析

通过PCR扩增猪圆环病毒2型HZ0201株的全长基因组,克隆到pBluescript SK+载体SacⅡ位点;同时以SacⅡ切出PCV2全长DNA,并进行自身环化,分别构建PCV2全长基因组重组质粒和首尾相接的环化DNA。利用脂质体分别将PCV2重组质粒和环化DNA转染PK-15和Vero细胞,免疫组织化学试验(IHC)结果显示二者均检出PCV2阳性抗原。其中PCV2环化DNA转染细胞的阳性率显著高于PCV2重组质粒。将转染细胞进行连续8次传代,以IHC对每代病毒检测表明,PCV2分子克隆在PK-15细胞中形成的病毒能稳定感染,并且滴度逐步增加;而在Vero细胞上复制能力不强,传到第四代即不能检出病毒。

猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响

采用阻断ELISA法对单独接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征组(hpPRRS,B组)及PCV2人工感染21d后接种hpPRRS疫苗组(PB组)不同时期血清中的PRRSV抗体进行检测,同时对不同时期前腔静脉血进行CD4/CD8流式细胞术及血常规分析。结果表明,在接种后32dB组白细胞含量极显著高于PB组(P<0.01),接种后62dB组淋巴细胞含量极显著高于PB组(P<0.01),接种后75dPB组幼稚型Th细胞含量显著高于B组(P<0.05),接种后32、62及75dB组Tc细胞含量为PB组的2.40、1.98和1.86倍,接种后32、48及62dB组记忆/激活Th细胞含量分别为PB组的1.54、1.46及1.32倍。

猪圆环病毒2型合并感染脑心肌炎病毒对仔猪的致病性分析

旨在研究猪圆环病毒2型(PCV-2)感染仔猪后造成免疫抑制条件下,探索合并感染脑心肌炎病毒(EMCV)对仔猪的生长性能影响和致病性分析。选取16头健康仔猪设计了EMCV攻毒组、PCV-2攻毒组、PCV-2/EMCV联合攻毒组和对照组,通过临床表现、组织病理学检测、生长性能、免疫指标以及排毒情况等多方面评价,对二者合并感染仔猪的影响进行了研究。结果显示,2种病毒单独感染后,均表现出各自的典型临床特征,危害均不严重。但合并感染后死亡率迅速上升,平均日增重显著降低,体重负增长率升高,心肌和脑组织变性、坏死更为严重,血液中淋巴细胞比率始终较低,EMCV中和抗体较长时间维持在低水平。EMCV排毒期可持续至感染后第12天,略长于EMCV单独攻毒组的第9天。研究结果证实,PCV-2先期感染可使EMCV对仔猪表现出更为严重的致病性和致死性,免疫功能降低,并可能使得EMCV在猪体内的复制、排毒能力增强。

高致病性猪蓝耳病毒及猪圆环病毒2型混合感染的诊断

[目的]对湖北省某猪场发生的以体温升高、部分病猪死亡等为主要特征的疾病进行诊断。[方法]采集发病猪的脾脏、淋巴结等样品,应用PCR方法进行实验室检测。[结果]经实验室检验,结合临床症状,诊断为HP-PRRSV及PCV2混合感染。高致病性猪蓝耳病毒阳性率为40%,猪圆环病毒2型阳性率为90%。[结论]通过采取综合防控措施,病情得到有效控制,减少了猪场的经济损失。

猪圆环病毒2型感染性克隆疫苗的研究前景

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV-2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原,此外还与猪皮炎与肾病综合征、仔猪先天性震颤、流产和渗出性皮炎等有关,这些疾病统称为猪圆环病毒病.该病广泛流行于世界各地,在我国猪群中流行较为严重,临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪细小病毒等混合感染,继发感染,给养猪业造成了巨大的经济损失.

一起高致病性猪蓝耳病和圆环病毒2型混合感染病例分析

对某发病猪场一起以呼吸道症状为主的败血性疾病进行了临床症状观察、病理剖检以及实验室病原PCR/RT-PCR检测,确诊为高致病性猪蓝耳病和圆环病毒2型混合感染。分析了发病原因并提出了防治措施,为养殖户提供案例参考。

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2。将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在。证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性。

猪圆环病毒2型重组病毒ZJ-R感染性克隆的构建

利用无缝克隆方法构建ZJ-R全长基因组的单拷贝分子克隆以及双拷贝串联分子克隆;通过生物信息学技术预测ZJ-R病毒结构蛋白的B细胞抗原表位,人工合成选定的表位肽,然后偶联KLH免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;免疫组化试验证实该多抗与转染PK15细胞的ZJ-R双拷贝串联分子克隆具有反应性。结果表明构建的ZJ-R双拷贝串联分子克隆具有感染性。

断奶仔猪圆环病毒2型与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊断

仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）主要是由猪圆环病毒2型（PCV2）感染6～8周龄仔猪所引起的一种以渐进性消瘦、黄疸、间质性肺炎及淋巴系统退化为主要症状的传染病[1-3].该病毒主要感染猪的免疫器官,造成免疫系统功能降低,该病发病症状与猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）等病毒感染相似,且也易混合感染,此外,PMWS也常引起细菌继发混合感染,给养猪业造成了巨大的经济损失[2-5].

猪圆环病毒2型与其他病原混合感染的致病性

猪圆环病毒2型（PCV2）于1997年首先被发现,并被确认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的重要病原。各国学者相继对PCV2病原学进行深入研究发现,除PMWS外,PCV2感染还与母猪繁殖障碍（RF）、断奶猪和育肥猪呼吸道综合征（PRDC）、增生性坏死性肺炎（PNP）、

抗猪输血传播病毒1型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗猪输血传播病毒1型(TTV1)Cap蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用PCR法扩增TTV1ORF1(1501 nt～2475 nt)编码重组Cap蛋白的C末端截短序列,将PCR产物克隆于pGEX-6P-1载体中,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达,获得含GST标签的重组蛋白(rCap),经SDS-PAGE和western blot鉴定表明rCap约为64.0 ku,以包涵体形式存在。用纯化的rCap免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗rCap蛋白的杂交瘤细胞株,MAb亚类均为IgG1/κ型;western blot鉴定表明有7株MAbs与rCap产生特异性反应,另1株MAb呈阴性。为验证8株MAbs与真核表达的Cap蛋白的免疫反应性,将全长与截短的TTV1 ORF1基因片段克隆于pcDNA3.1载体,转染293T细胞进行蛋白瞬时表达,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法检测表明,这8株MAbs均能够与瞬时表达的全长rCap产生特异性反应,其中6株与截短表达的rCap反应。本研究表达的rCap蛋白及制备的MAbs,为该病毒检测方法的建立及抗原表位的鉴定奠定了基础。

猪圆环病毒2型引起急性肺水肿新症状

猪圆环病毒（PCV）是迄今发现的最小动物病毒之一，现已知PCV有两个血清型，即PCV—1和PCV-2。PCV-1为非致病性的病毒，PCV-2为致病性的病毒。PCV-2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，PMWS最早发现于加拿大。最近在美国有学者报道，猪圆环病毒出现一种新的表现症状，称为急性肺水肿型（APE），它主要影响刚出生和刚断奶的小猪，

一例高致病性蓝耳病病毒、圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊断

目前,猪场疫病混合感染的现象普遍存在,给我国养猪业造成了巨大损失。2013年10月,广西省某集约化猪场约6周龄猪群发生以高热、皮肤发绀、呼吸困难、关节炎为主要特征的传染病。根据发病情况、临床症状、剖检变化并结合实验室诊断方法进行综合诊断,最终结果显示,导致该猪场大规模发病并死亡的主要病原包括高致病性猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌,是典型的混合感染导致大规模发病及死亡的案例。