猪逆转录病毒与生物人工肝的使用

生物型人工肝 (bioartificialliver,BAL)或组合型生物人工肝 (hybridbioarti ficialliver,HBL) ,是目前国内外公认最接近自然肝脏 ,功能也最全面的人工肝脏支持系统[1 ] 。所谓生物型人工肝 ,就是在整个治疗系统中包含有活的肝细胞或组织 ,因此具有相应生物活性的人工肝支持系统。在生物人工肝领域 ,因为猪解剖、生理特点与人类相似 ,猪细胞来源广泛 ,经济适用 ,因此目前应用最多的生物部分是猪肝脏细胞。但目前已知 ,作为异种细胞猪肝细胞内存在着猪内源性逆转录病毒 (porcineendogenousretrovirus,PERV) ,有引起生物人工肝治疗患者PERV感染的危险。因此 。

猪逆转录病毒与生物人工肝及细胞移植

生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的研究热点,猪肝细胞因其来源广泛、功能稳定、解剖及生理与人相近、不易患病等优点成为目前生物人工肝及细胞移植使用较多的生物材料之一,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcineendogenousretrovirus熏PERV)感染体外培养人细胞以来,跨种族间感染越来越引起人们的重视。本文拟就该病毒在生物人工肝及细胞移植中的研究进展综述如下。

异种肝肾联合移植中猪内源性逆转录病毒的检测

目的检测猪内源性逆转录病毒(PERV)基因在异种肝肾联合移植供受体中的表达,以期为PERV的跨物种传播提供参考依据。方法以6基因编辑猪恒河猴肝肾联合移植的组织样本作为研究对象,采用RT-PCR和PCR技术检测移植前后供受体不同组织中PERV编码基因、PERV各亚型以及猪线粒体细胞色素B基因的表达情况。结果供体猪的不同组织中存在PERV编码基因gag和pol、PERV-A和PERV-B亚型以及猪线粒体细胞色素B基因,但不存在PERV-C亚型。移植终点时受体不同组织中均未检出PERV基因序列。结论基因编辑猪恒河猴异种肝肾联合移植受体存活的14 d内没有发生PERV的跨物种传播。

异种移植中猪内源性逆转录病毒的传播

器官移植是治疗各类终末期疾病最有效的手段,为了解决器官移植中供体短缺的问题,人们开始探究异种移植的可能。猪是异种器官移植常见的供体来源之一,猪器官作为连接两个物种间的桥梁,其携带的病毒有可能在物种间传播并存在引起人畜共患病的风险。猪内源性逆转录病毒(PERV)整合在基因组中,是一种跨物种传播的逆转录病毒。本文介绍了PERV传播特性的影响因素、PERV及其重组病毒的传播风险以及异种移植试验中PERV的检测与传播风险评估,以期为缓解器官移植供体严重短缺的现状,推动异种移植技术的发展提供参考。

应用PCR和RT-PCR检测猪内源性逆转录病毒及其意义

目的 观察猪内源性逆转录病毒 (Porcineendogenousretrovirus ,PERV)在中国实验小型猪的感染情况。方法 针对PREVgag区的序列 ,选用特异性引物 ,采用PCR方法检测猪肝脏、皮肤前病毒序列 ;以及RT PCR方法检测血清中PERV RNA序列。结果 该法在猪肝脏组织中可检测出PERV前病毒序列 ;此外 ,在猪血清标本亦检测出病毒序列 ,而其它 2份HBV、HCV阳性血清及 2份其它动物血清 (大鼠、兔 )检测结果均为阴性 ,说明该方法特异性较高。结论 中国实验小型猪均携带该病毒 ,并可以释放到血清中 ;采用该法具有特异、简便的特点 。

猪逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的开发一种能够准确、灵敏、特异检测猪逆转录病毒(PERV)的荧光定量PCR方法。方法根据GenBank数据库中PERV Gag基因的高度保守序列,设计1对特异性引物,建立用于检测PERV的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,并验证其灵敏性、重复性和特异性。结果建立的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.998。该方法检测PERV下限为2.04×10^(2)copies/μl,批内批间变异程度较低,变异系数小于2%,且与PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和SVA等均无交叉反应。利用该qPCR方法对采集的49份猪组织样品进行检测,阳性率为81.63%,高于普通PCR阳性检出率的73.47%。结论建立的快速、定量检测PERV的SYBR Green I qPCR方法敏感、特异,具有一定的应用前景。

湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒的研究

为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据,从湖南沙子岭猪的保种群内随机采集31头个体的耳样组织,应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的前病毒DNA和mRNA,并对PCR扩增的灵敏性进行评估。多组织RT-PCR检测3头沙子岭猪肾、心、肝、肺、脾等组织中PERV的表达情况,了解其在各组织中的分布情况;最后,扩增、测序该猪种的env基因,结果用NCBI中的BLAST软件进行分析。PCR和RT-PCR结果表明,所检测的31头沙子岭猪均带有PERV前病毒DNA,耳样组织中均有PERV mRNA表达,其中有2头个体携带env-A、env-B、env-C3种囊膜蛋白基因,而其余的29头个体只带有env-Ae、nv-B两种囊膜蛋白基因,未检测到env-C基因。多组织RT-PCR扩增结果表明,3头沙子岭猪的肾、心、肝、肺、脾等组织中,pol、gage、nv-A、env-B基因均有表达,未检测到env-C基因表达。测序沙子岭猪的env基因,结果发现,沙子岭猪env-B和env-C基因与其他猪种序列比较分别存在2和10个碱基的差异,而env-A基因序列没有差异,说明不同的猪种之间env基因存在多态性。以上结果表明,沙子岭猪种群携带PERV,其亚型主要以PERV-A,B为主;PERV在该猪种肾、心、肝、肺、脾等多种组织中的分布没有明显组织特异性,且93.5%(29/31)个体表现为env-C基因缺失,提示沙子岭猪作为候选猪种可能在异种移植中具有较好的应用前景。

湖南大围子猪内源性逆转录病毒的研究

目的:研究湖南大围子猪携带的内源性逆转录病毒(porcineendogenousretrovirus,PERV),为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法:从湖南大围子猪的保种群内随机采集42头个体的耳样组织,应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中PERV前病毒DNA和mRNA,并对PCR扩增的灵敏性进行评估。扩增、测序大围子猪的PERVenv基因,结果用美国生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的BLAST软件进行分析。结果:所检测的42头大围子猪均带有PERV前病毒DNA,耳样组织中均有PERVmRNA表达,所有个体携带env-A,env-B和env-C3种囊膜蛋白基因。测序结果表明,大围子猪env-A和env-C与GenBank登录其他猪种序列(AY288779,AY534304)相比分别存在1和8个碱基的差异,而env-B基因没有碱基差异。结论:大围子猪种群携带PERV,而且均具有转录活性,亚型主要为PERV-ABC;大围子猪的PERVenv-A,env-C存在基因多态性,从生物安全性方面考虑,该猪种不宜作为异种移植供体。

中国两种地方猪种内源性逆转录病毒的亚型分析

目的 对两种中国地方猪种 (五指山猪和版纳微型猪近交系 )的 86头个体进行猪内源性逆转录病毒(PERV)亚型分析。方法 取引物 Env A、Env B和 Env C分别用于鉴定 PERV的 A、B和 C亚型 ,并对 86头个体进行PCR法分析。结果 在所有被检测个体中 ,77.9%的个体的基因组中同时有 PERV的 A、B两种亚型 ,另外 2 2 .1%的个体的基因组中则只有 PERV的 A或 B亚型 ;所有个体的外周血白细胞中均未检测到 PERV的 C亚型。结论 PERV在中国五指山猪和版纳微型猪近交系的外周血白细胞中只有 A、B两种亚型 ,并且以

湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为探明湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒携带情况及病毒亚型分布,应用gag,pol特异性引物,对31头湖南沙子岭猪耳部组织的DNA,RNA样品进行了PCR,RT-PCR检测,依据env基因表型env-A,env-B,env-C,鉴定了每头猪携带PERV亚型.结果表明,在所检31头个体中,93.5%的个体基因组中同时有PERV的A,B 2种亚型(记为env-AB),另外6.5%的个体基因组中则同时有PERV的A,B,C 3种亚型(记为env-ABC),所有个体的耳样组织中均未检测到单独存在的PERV的A,B或C亚型.说明湖南沙子岭猪中存在PERV序列,且能以mRNA的形式表达,病毒亚型以env-AB为主.

内源性逆转录病毒在五指山小型猪体内存在状况的分子微生物学调查

根据猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因和β-肌动素(β-actin)基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析。结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%。所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达。各组织gag mRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低。各组织envA、envB mRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB。以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异。

猪肝细胞和培养上清液中猪内源性逆转录病毒的检测

建立了猪肝细胞及其培养上清液中猪内源性逆转录病毒(PERV)的检测方法,探讨了其在猪肝细胞生物人工肝应用中的意义。以PERVgag基因为靶序列,选用特定的引物,PCR检测中国实验用小型猪肝细胞PERV前病毒DNA;RT-PCR检测猪、犬、大鼠以及HBV阳性病人血清和猪肝细胞培养6h、24h时的上清液PERVRNA,同时检测猪肝细胞猪线粒体DNA(mtDNA)。研究结果表明:检测5份中国实验用小型猪血清、肝细胞及培养猪肝细胞24h时的上清液PERV均为阳性,而5份培养猪肝细胞6h时的上清液、5份犬血清、5份大鼠血清和5份HBV阳性病人血清PERV检测结果均为阴性,猪肝细胞中均可检测到猪mtDNA。因此,中国实验用小型猪肝细胞携带PERV;PERV可释放到血清中;猪肝细胞培养24h后该病毒颗粒已释放到培养液中;PCR和RT-PCR方法检测PERV具有特异性强、简便的特点。

猪内源性逆转录病毒在家猪细胞中的检测

目的研究家猪(大白猪×杜洛克猪)体内猪内源性逆转录病毒(PERV)的存在和表达。方法采用PCR方法检测猪外周血单个核细胞、肝细胞中PERV前病毒序列;用RT-PCR方法检测家猪血清中PERVRNA序列。结果PCR方法测定猪外周血单个核细胞、肝细胞阳性率分别为40%、100%,RT-PCR方法测定家猪血清阳性率为33.3%。结论家猪体内有PERV的存在和表达,但其外周血单个核细胞、血清PERV的阳性率分别较中国实验用小型猪、大白猪为低,说明不同猪种之间PERV的存在和表达存在较大差异,筛选PERV基因拷贝数低甚至无PERV存在和表达的猪种是今后猪器官细胞医学应用的一个方向。

四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究

目的检测四种小型猪在内源性逆转录病毒基因(PERV)拷贝数上的差异,试图找出不含或含有较低拷贝数的个体或品种。方法采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数。结果贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221)。尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义。结论四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,表明其用于异种器官移植研究的可行性。

新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究

目的:探讨猪肝细胞为基础的新型生物人工肝(BAL)系统体外灌流后及治疗急性肝衰竭(ALF)犬后猪内源性逆转录病毒(PERV)的传播。方法:构建新型BAL,应用BAL进行体外灌流6h。采用门腔分流及胆总管结扎切断术建立犬ALF模型,应用BAL治疗ALF犬6h。采用PCR检测灌流前猪细胞中PERV原病毒DNA和猪mtDNA,采用RT-PCR检测灌流前后中空纤维管内腔循环液和治疗前后犬血清PERV RNA。结果:猪细胞可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA,灌流前后中空纤维管内腔循环液和犬血清PERV RNA均为阴性。结论:猪肝细胞为基础的新型BAL体外灌流和用于ALF犬治疗6h后未发现PERV传播。

壳聚糖纳米纤维支架对猪肝细胞分泌猪内源性逆转录病毒的影响

探讨壳聚糖纳米纤维支架对肝细胞的PERV分泌量以及其感染性的影响。将新鲜分离的猪肝细胞接种于壳聚糖纳米纤维支架或普通条件下连续培养7 d,分为实验组(Nano组)和对照组(Hep组)。每天收集培养液检测逆转录酶(RT)活性,并通过RT-PCR和实时定量PCR测定PERV RNA水平。通过western blot检测细胞裂解液中PERV gag 30蛋白含量。细胞培养液体外孵育HEK293细胞以测定其感染性。结果表明:实时定量PCR、RT活性以及western blot具有相似的变化趋势。在体外培养10 h和2 d出现PERV分泌高峰然后逐渐下降。除第6 dPERV RNA水平和第5 d蛋白水平实验组明显高于对照组外,其余均无明显差异。体外感染实验无HEK293细胞感染。壳聚糖纳米纤维支架会延长猪肝细胞的PERV分泌时间但对分泌量以及体外感染性并无明显影响,可安全用于生物人工肝。

猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究

目的检测猪内源性逆转录病毒(PERV)在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达。方法通过提取已建立的版纳微型猪近交系(BM I)骨髓间充质干细胞(M SC s)永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT-PCR方法检测PERV前病毒gag、po l和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定。结果从原代BM I-M SC s至连续传代到150、180代的BM I-M SC s细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达,PERV亚型为PERV-A、B型。结论PERV在BM I近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消失,PERV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达。

中国版纳微型猪近交系内源性逆转录病毒酶活性的定量检测

采用 Roche公司的 RT(Reverse transcriptase,RT)检测试剂盒 ,按其操作步骤进行 ,用 HIV- 1作为试剂盒的阳性参照绘制标准曲线 ,PK15作为猪内源性逆转录病毒 (Porcine endogenous retrovirus,PERV)的阳性对照 ,定量检测 34头中国版纳微型猪近交系 (Banna minipig inbreed,BMI)血浆中表达的 PERV的逆转录酶。各猪RT结果均于 4 0 5 nm处测定 OD值 ,用 HIV- 1的实测标准曲线进行定量 (pg/ m l)。检测结果表明全部 34头猪均为阳性反应 ,但各猪血浆中有活性的酶远低于 HIV- 1,也弱于