猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子的原核表达及单克隆抗体制备

【目的】制备猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)及其单克隆抗体,为建立猪源SLPI检测方法及其功能研究提供试验材料。【方法】将经串联的猪源SLPI基因克隆至pET-28a(+)、pGEX-6P-1载体构建重组表达载体;利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况;重组菌经超声破碎以镍柱对重组蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合制备杂交瘤细胞,采用间接ELISA筛选和鉴定所制备单克隆抗体和亚类,利用Western blotting及间接免疫荧光(IFA)方法鉴定单克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建了pGEX-6P-1-SLPI、pET-28a-SLPI重组质粒,获得纯度较高的His-SLPI、GST-SLPI重组蛋白,分子质量分别为27和50 ku,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达;获得3株可稳定分泌抗猪SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,9D10为IgG3亚类,9G11、10E2为IgG2b亚类;3株单克隆抗体均可与猪肠上皮细胞内的SLPI结合,9D10在细胞核中显示较强的荧光信号,而9G11、10E2在细胞浆和细胞核中均有荧光信号。【结论】本研究成功制备了重组His-SLPI和GST-SLPI蛋白,获得3株稳定分泌抗猪源SLPI单克隆抗体,特异性良好,为进一步研究猪源SLPI特性及其在黏膜免疫中的作用搭建技术平台。

山猪群体钙调蛋白酶抑制蛋白基因遗传变异研究

目的:研究猪钙调蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在山猪群体的遗传变异情况,为山猪肉质研究奠定基础。方法:应用PCR-SSCP技术和测序方法检测山猪及其杂种猪CAST基因的遗传多态性,并与其他品种猪相应序列进行比较。结果:用pCT1引物在山猪及其杂种群体中检测到2个多态位点(A,B),用pCT2引物检测到3个多态位点(C,D,E);序列分析表明,C和E位点共同拥有6处变异。结论:通过与其他猪品种比较,发现山猪的CASTMsp基因型分布与梅山猪的基因型分布完全一样,而与国外品种猪的基因型分布差异明显。

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制分子Ts-serpin-2对人THP-1细胞炎性细胞因子的表达影响

为了深入研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制分子(Ts-serpin-2)对THP-1细胞炎性细胞因子分泌的调节作用,本实验通过RTPCR从猪带绦虫成虫扩增获得Ts-serpin-2(TsM_000807300)的编码序列CDS,利用毕赤酵母表达Ts-serpin-2重组蛋白。利用发色底物特异性反应检测Ts-serpin-2蛋白对猪胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶、牛α-糜蛋白酶、猪胃蛋白酶、木瓜酶、凝血酶和组织蛋白酶G的抑制效果。重组蛋白Ts-serpin-2处理THP-1细胞24 h,应用qRT-PCR和ELISA方法检测各炎性细胞因子差异表达水平。结果显示,真核酵母表达的重组蛋白Ts-serpin-2分子量约为48 kDa,具有蛋白酶抑制活性,对牛α-糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶及猪胰蛋白酶的活性均有明显的抑制作用。重组蛋白Ts-serpin-2可抑制LPS活化的THP-1细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12α、IFN-γ和iNOS2 mRNA的转录水平,促进IL-4刺激的THP-1细胞抗炎性细胞因子IL-10的表达。ELISA结果显示,Ts-serpin-2能够抑制巨噬细胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6和IFN-γ,刺激IL-10的分泌,与qRT-PCR检测结果基本一致。上述研究结果表明猪带绦虫Ts-serpin-2可通过调节宿主巨噬细胞分泌的炎性因子影响虫体入侵过程中宿主的免疫应答。

日粮不同蛋白质水平对猪骨骼肌钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因表达及嫩度的影响

为研究饲料不同蛋白质含量对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量,选用54头约50kgLY(长×大)二元杂交去势公猪,随机分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复3头猪,分别饲喂蛋白质水平为10%、18%和26%的日粮,各日粮能量及氨基酸模式保持一致,饲养76d后屠宰取样,用荧光相对定量PCR测定猪背最长肌中calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量,及其对剪切力的影响。结果表明,日粮不同蛋白质水平对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响(P<0.01)。calpastatin mRNA在骨骼肌中的表达量随日粮蛋白质水平的升高而升高。μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量随日粮蛋白质水平的升高而下降。骨骼肌剪切力与calpastatin表达量显著正相关,骨骼肌中calpastatin mRNA的表达量越高,骨骼肌剪切力值越高(P<0.01),相关系数为0.859。骨骼肌剪切力与μ-calpain显著负相关,骨骼肌中μ-calpain mRNA的表达量越高,骨骼肌剪切力值越低(P<0.05),相关系数为-0.748。骨骼肌中calpastatin mRNA的表达量与μ-calpain mRNA的表达量显著负相关,calpastatin mRNA表达量越高,μ-calpain mRNA的表达量越低(P<0.01),相关系数为-0.875。即日粮不同蛋白质水平对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响。

不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因表达及剪切力的影响

为研究不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)和μ-钙蛋白酶(μ-calpain)mRNA丰度,以及对肌肉剪切力的影响,54头约60kg的杜×长×大三元杂交去势公猪被随机分为3个组,每组3个重复,每个重复6头猪。第1组为对照组,自由采食;第2组为补偿生长组,前20d限饲30%,后20d自由采食;第3组为限饲组,全期限饲30%。所有猪饲养40d后屠宰取样,用实时定量PCR测定猪背最长肌中calpastatin和μ-calpain mRNA相对丰度。结果表明,背最长肌calpastatin和μ-calpain mRNA相对丰度在自由采食组和补偿生长组间差异不显著(P>0.05);在补偿生长组和限饲组间差异显著(P<0.05);在自由采食组和限饲组间差异极显著(P<0.01)。背最长肌剪切力与calpastatin表达量显著正相关,相关系数为0.5059。背最长肌剪切力与μ-calpain相对丰度显著负相关,相关系数为-0.4757。背最长肌中calpastatin mRNA相对丰度与μ-calpai nmRNA相对丰度负相关,相关系数为-0.0559。结果表明补偿生长和限饲均可以增强calpastatin和μ-calpain基因在转录水平的调控。

猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的多态性分析

钙蛋白酶抑制蛋白的638位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为精氨酸(Arg)可改善猪的肉质,是一个有重要育种应用前景的分子标记。本研究采用PCR-RFLP技术对47头莱芜猪,53头大白猪,45头杜洛克和60头商品杂交猪共205个个体钙蛋白酶抑制蛋白Ser638Arg突变的多态性进行了分析。结果表明:4个猪群均检测到AA、CA和CC3种基因型。其中莱芜猪突变等位基因A频率最低,为0.415;大白猪、杜洛克和商品杂交猪A的频率分别为0.632、0.800和0.750。莱芜猪A的基因频率极显著低于其他4个猪种(P<0.01)。所检测的4个猪群在该突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

猪钙蛋白酶抑制蛋白基因PCR-RFLP多态性与肉质性状及背膘厚间的关系分析

钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)是钙蛋白酶系统的内源性抑制剂,并且已经被确定能影响宰后肉的嫩度。本研究采用PCR-RFLP技术,分析了CAST基因在125头PIC杂交猪中的多态性分布及其与肉质性状和背膘厚间的相关。结果发现,CAST基因在本研究所检测的位点均具有多态性。进一步分析表明,CASTA2A2基因型个体与其相应的另外两个基因型个体相比肌内脂肪含量有显著差异,CASTB1B2基因型个体对于肌内脂肪含量的影响也有相同的趋势;CASTB1B2基因型个体与其相应的另外两个基因型个体相比背膘厚有显著差异,CASTC1C2基因型个体和CASTD1D2基因型个体对于背膘厚的影响也有相同的趋势。因此可以把CAST基因作为影响猪肉质性状和屠体性状的候选基因。

高氧气调包装对宰后猪肉蛋白质氧化、钙蛋白酶活性及蛋白质降解的影响

【目的】研究高氧气调包装(Hi Ox,80%O2/20%CO2)对宰后猪肉蛋白质氧化、钙蛋白酶活性及蛋白质降解的影响,探讨高氧气调包装影响猪肉品质的内在机制。【方法】选取12条冷却(4℃)24 h后的杜洛克×长白×约克夏三元杂交猪背最长肌,分别进行高氧气调包装和真空包装(VP),4℃冷库贮藏,分别在1、4、6 d测定羰基含量及分布、巯基含量、肌节变化、钙蛋白酶活性、肌联蛋白及肌钙蛋白-T降解变化。【结果】高氧气调包装组羰基含量高于真空包装组且贮藏第4和6天差异显著(P<0.05)。贮藏第1和4天,高氧气调包装组肌细胞外围出现羰基氧化荧光信号,荧光以靠近细胞膜处密度更高,并且逐渐向细胞内部扩散;贮藏第6天,高氧气调包装组细胞膜呈高亮荧光圈,胞内荧光增强,而真空包装组荧光信号较弱。贮藏第6天,高氧气调包装组巯基含量显著低于真空包装组(P<0.05)。真空包装组宰后肌节M线弱化、A带模糊、肌原纤维Z线断裂;高氧气调包装组肌节结构相对完整。高氧气调包装组在贮藏第1天钙蛋白酶活性显著低于真空包装组(P<0.05);高氧气调包装抑制了肌联蛋白和肌钙蛋白-T的降解,且在贮藏第4和6天差异显著(P<0.05)。【结论】高氧气调包装能够显著提高宰后猪肉蛋白质氧化程度,抑制钙蛋白酶活性发挥及其底物蛋白质的降解。

西罗莫司转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂治疗肾移植术后糖尿病

目的评价西罗莫司(SRL)转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂(CNI)治疗肾移植术后糖尿病的安全性及疗效。方法回顾性分析我院近10年321例肾移植术后患者,其中有34例(10.59%)诊断为肾移植术后糖尿病,按治疗方案分为3组:A组(14例)为标准化的CNI减量方案,B组(12例)为SRL转换CNI药物方案,C组(10例)为口服降糖药物,所有患者均辅助饮食及运动疗法。当餐后血糖超过14.0 mmol/L时,餐前均辅助皮下注射短效胰岛素治疗并维持治疗,并规律随访5年。结果所有入组患者诊断肾移植术后糖尿病时血糖平均13.02±1.74 mol/L,3组间无显著性差异(P>0.05)。经辅助治疗6月后,A、B、C组患者血糖分别平均下降至8.05±2.45、7.45±2.44和9.30±3.89 mmol/L。经调整胰岛素剂量12月后A组和B组患者血糖均降至正常,但日均胰岛素用量,A组患者明显多于B组(P<0.05)。SRL组转换时的肌酐165.1±61.8 mmol/L,转换5年后肌酐150.0±53.0 mmol/L(P<0.05);CNI减量组治疗前肌酐152.0±43.0 mmol/L,5年后肌酐是145.9±53.0 mmol/L;C组患者肾功能没有在治疗中获益,治疗后肌酐上升。A组患者5年生存率人/肾分别是100%和75%,与B组患者人/肾生存率83.4%和68%,两组无显著性差异(P>0.05),C组患者5年生存率分别是71.8%和52.4%,明显低于A组和B组。结论肾移植术后行SRL转换CNI药物有利于改善肾移植术后糖尿病且不增加排斥风险。

猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的基因型与肉质性状的关联性分析(英文)

钙蛋白酶抑制蛋白基因是影响肉质性状的候选基因之一.本研究以125头地方猪和117头外来猪为材料,研究CAST基因的多态性.结果在CAST基因上检测到一个多态性位点(A876G),并引起了氨基酸残基的改变Lys250 Arg.在地方猪种中仅检测到G(Arg)等位基因,而在外来猪种中A(Lys)和G(Arg)两个等位基因均检测到.基因型与肉质性状的关联性分析结果表明,CAST基因型与肌肉的嫩度,屠宰45 min后的pH值及滴水损失存在强相关.又由于地方猪种与外来猪种的肉质性状间存在显著差异,因此,在CAST基因上检测到的多态型位点Lys250Arg的基因型效应有待于进一步研究,并将其有效应用于商品猪生产中.

泛素蛋白酶体抑制剂抑制钙调神经磷酸酶依赖的心肌细胞肥大

目的研究泛素蛋白酶体抑制剂MG262对钙调神经磷酸酶信号通路的影响,探讨其抑制心肌细胞肥大的机制。方法在去甲肾上腺素诱导培养的乳鼠肥大心肌细胞中加入MG262,通过Phalloidin染色观察细胞的形态,RNA Dot Blot检测胚胎蛋白基因表达,Western blot检测细胞中钙调神经磷酸酶蛋白含量,免疫荧光标记观察活化T细胞核因子c4(NFATc4)蛋白在细胞内分布。结果去甲肾上腺素使细胞面积增大近1.1倍,胚胎基因心房利钠因子(ANF)、脑钠肽(BNP)、β肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA表达上调,细胞核内NFATc4蛋白表达水平增加。MG262明显抑制去甲肾上腺素诱导的细胞肥大(P<0.05)和ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达上调(P<0.05),细胞面积下降了33%;同时MG262使去甲肾上腺素诱导的细胞钙调神经磷酸酶蛋白表达水平下降,抑制NFATc4核内转位。结论 MG262可能通过抑制钙调神经磷酸酶信号通路,减轻心肌细胞肥大。

肾移植术后糖尿病患者应用环孢素转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂(CNI)治疗的有效性和安全性分析

目的:对肾移植术后糖尿病患者应用环孢素转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂(CNI)治疗的有效性和安全性进行分析。方法:选择了2016年8月至2018年9月在我院进行了肾移植术后糖尿病治疗的64例患者为对象,采取随机分组法将患者分成了对照组(n=32)和观察组(n=32)。对照组采取常规降糖药物进行治疗,观察组则使用环孢素转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂(CNI)进行治疗,之后对比两组患者治疗前后血糖情况、5年后的人生存率以及肾生存率。结果:在进行治疗前,两组患者空腹血糖之间的对比没有统计学意义(P>0.05);在治疗之后,对照组患者6个月以及12个月的空腹血糖显著高于观察组,P<0.05差异存在统计学意义。对照组中患者在5年之后的人生存率以及肾生存率显著低于观察组,P<0.05差异存在统计学意义。结论:在进行肾移植术后糖尿病患者的治疗时,采取环孢素转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂进行治疗具有较高的治疗效果,安全性也较高,值得在临床推广。

不同饲喂方式对生长猪背最长肌中钙蛋白酶抑制蛋白表达量以及肉嫩度的影响

为研究不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)表达量以及肉嫩度的影响,选用54头约60kg的三元杂交生长肥育猪,随机分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复6头猪,分别按照自由采食组(对照)、限饲组(30%)、补偿生长组(前20d限饲30%后20d自由采食)进行不同的饲养。试验结果表明:自由组、补偿生长组、限饲组的肌纤维剪切力和钙蛋白酶抑制蛋白表达量依次显著升高,且随着钙蛋白酶抑制蛋白表达量的增多,剪切力值有上升的趋势。

三个猪品种钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性研究

采用3种限制性内切核酸酶对杜洛克、内江猪和荣昌猪共153头的钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因进行PCR-RFLP分析。结果表明:①HinfI、MspI和RsaI均检测到多态性,同时还发现一个杜洛克个体的HinfI-RFLP出现120bp突变片段。②X2检验表明,HinfI、MspI和RsaI酶切所产生的基因及基因类型处于Hardy-Weinberg平衡状态(p<0.05);杜洛克、内江猪和荣昌猪三个品种猪的优势基因型分别为ABCCEE、AACCEE、AACCFF,在99%程度上分别与相应的品种有关。

肾移植术后糖尿病采用西罗莫司转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂治疗的临床效果分析

目的探讨肾移植术后糖尿病采用西罗莫司转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂治疗的临床效果。方法对40例肾移植术后糖尿病患者临床资料进行回顾性分析,将其均分为治疗组(西罗莫司转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂)和对照组(降糖药物)(n=20),通过不同治疗方法,对2组患者临床治疗效果进行对比分析。结果 2组患者治疗前空腹血糖水平差异无统计学意义;治疗后,2组患者空腹血糖均显著低于治疗前(P<0.05),且治疗组患者治疗后空腹血糖显著低于对照组患者(P<0.05);治疗组患者治疗5年后人生存率为85.00%、肾生存率为75.00%,与对照组患者的60.00%和50.00%相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论肾移植术后糖尿病临床上采用西罗莫司转换钙调磷酸蛋白酶抑制剂治疗临床效果较为理想。

钙蛋白酶抑制蛋白对猪肉品质的影响

钙蛋白酶蛋白系统是影响肌肉生长和宰后肉嫩化的一个重要因素,主要由钙蛋白酶(μ-calpain和m-calpain)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)及骨骼肌特异性钙蛋白酶组成,钙蛋白酶抑制蛋白是一种内源性专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白,参与了调控肌原纤维蛋白的降解并在其中发挥了关键作用。本文概述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构、功能及其对肌肉蛋白质的增加、提高肉嫩度的作用。

钙蛋白酶抑制蛋白对猪肉肉质的影响

钙蛋白酶系统主要由钙蛋白酶(u2-calpain,CAPN1;m2-calpain,CAPN2)及钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)组成,calpain是存在于细胞质中的依赖于Ca2+的钙中性蛋白酶,蛋白酶系统是主要的蛋白质降解物。calpastatin是钙蛋白酶的内源性抑制蛋白。研究表明,Calpastatin在肌原纤维蛋白降解中起着重要作用。因此,对肌肉生长和嫩度有重要影响。本文综述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构组成,对肉嫩度影响的机理和钙蛋白酶抑制蛋白基因的定位。

亲属活体供肾移植后低剂量钙调蛋白酶抑制剂的应用(英文)

背景:亲属活体肾移植供、受者移植前准备充分,供肾热、冷缺血时间较短,HLA配型的组织相容性好,移植后排斥反应发生率低,为亲属活体供肾肾移植后采用低剂量免疫抑制剂方案提供了可能性。目的:探讨亲属活体供肾移植后低剂量钙调蛋白酶抑制剂的安全性和有效性。方法:选取2006-01/2008-06在南京医科大学第一附属医院肾移植中心行亲属活体供肾移植的受者38例,移植后常规使用环孢素A/他克莫司+吗替麦考酚酯+泼尼松的三联免疫抑制方案。将38例患者随机分为两组:CNI常规剂量组(n=18),移植后初始药物剂量为环孢素A6mg/(kg·d)或他克莫司0.12mg/(k·d);CNI低剂量组(n=20),术后初始药物剂量为环孢素A4mg/(kg·d)或他克莫司0.08mg/(kg·d);两组吗替麦考酚酯和泼尼松使用剂量相同。移植后密切随访,比较两组患者移植后不同时期的肾功能以及急性排斥反应、肺部感染、肝功能损害、肾毒性等并发症的发生情况。结果与结论:随访12个月,CNI常规剂量组重度肺部感染死亡1例,CNI低剂量组无死亡病例。两组移植肾功能及急性排斥反应发生率比较差异均无显著性意义(P>0.05);CNI低剂量组肝功能损害、钙调蛋白酶抑制剂肾毒性发生率显著低于CNI常规剂量组(P<0.05)。此外,采用低剂量钙调蛋白酶抑制剂免疫抑制方案明显减轻了亲属肾移植患者的经济负担。说明亲属活体供肾移植后采用低剂量钙调蛋白酶抑制剂的免疫抑制剂方案安全、有效。

钙蛋白酶(Calpain)抑制剂药理活性的研究进展

钙离子(Ca^(2+))作为细胞的第二信使,是参与人体内各项活动的重要调控因子,钙蛋白酶(Calpain),它是一种中性半胱氨酸蛋白酶,主要受Ca^(2+)激活,Calpain在许多生理过程中发挥了很大的作用,例如细胞周期的调控与凋亡,还有细胞信号转导和葡萄糖转运等.近年来,人们对这类酶的兴趣大大增加,因为它与脑缺血和其他神经损伤、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、心肌缺血相关的神经细胞死亡有很大关系,因此本文对钙蛋白酶抑制剂在神经细胞损伤、失血性休克、缺血再灌注以及阿尔茨海默病研究等方面进行了综述.

钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制系统在雌性生殖调控中的研究进展

钙蛋白酶-钙蛋白酶抑制蛋白系统在多种细胞中发挥作用,在雌性生殖系统中其对卵母细胞、子宫与胎盘的调控也起着重要作用。对该系统在雌性生殖调控中的作用的研究进展进行了综述,为进一步了解该系统奠定基础。