2型猪链球菌天津分离株的鉴定及其遗传特征分析

为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75。测定其生长曲线、并按照文献方法进行溶血性试验、黏附/侵入试验和对小鼠的致病性试验,分析该SS2分离株特性。结果显示,TJS75菌株经TSB培养6 h~15 h可达对数生长期,对绵羊血红细胞(RBC)具有崩解效果,可黏附并侵入PK-15细胞(黏附率和侵袭率分别为5.16%和7.90%),且感染TJS75株的BALB/c小鼠出现不同程度的行动迟缓、呼吸急促、精神萎靡和神经症状等,经测定其LD50为2.15×107cfu/mL。进一步采用高通量测序,并预测其毒力基因,分析该菌株的遗传特征,结果显示,TJS75菌株基因组全长2368195 bp,GC含量40.88%,含有2299个编码基因,其中有1822、1830和1077个基因分别注释于GO、COG和KEGG数据库,携带的16S r RNA基因序列与国内分离的SS强毒株98HAH33和05ZYH33的亲缘性较近,毒力基因的预测结果显示该菌株携带499种毒力相关基因(编码173种毒力相关因子),依据功能分类,这些毒力基因参与SS2的黏附和侵袭、溶血、促进铁转运、自溶酶的合成、降解胶原酶、唾液酸的合成等。本研究首次分离到携带MRP毒力因子的ST25型SS2,为深入开展SS2 TJS75株的致病机制研究提供了科学依据。

猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化

根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·mL-1、变性温度为94℃、变性时间为1min、探针浓度为0.5umol·mL-1、杂交温度55℃、杂交时间1min、一抗作用时间45min、二抗作用时间40min时检测方法敏感性最好,特异性最强。通过对17个阴性样本检测,测得平均值为0.057,方差为0.047,计算得临界值为0.198。

2型猪链球菌pnp基因缺失株与回补株的构建及其生物学特性的研究

为研究2型猪链球菌(SS2) pnp基因的生物学功能,本研究通过基因无痕操作技术构建SS2 05ZYH33pnp基因缺失株Δpnp以及回补株CΔpnp,经PCR和测序鉴定结果表明,正确构建了pnp基因无痕缺失株和回补株。将05ZYH33、Δpnp以及CΔpnp分别在不同温度(28℃、37℃、42℃)培养后测定OD_(600nm)值,绘制各菌株的生长曲线;利用革兰氏染色后经镜检及透射电镜观察各菌株的形态结构;通过滴定微孔平板结晶紫法检测各菌株的生物被膜形成能力;采用接触法分析各菌株的溶血特性;于含不同抗生素的THB平板上培养各菌株,分析各菌株的药物敏感性;于氧化条件与酸性条件下培养各菌株,通过统计存活率评价各菌株的氧化耐受与酸耐受能力。结果显示,缺失株的生长速率明显低于野生株和回补株,且在冷应激条件下的生存能力下降;与野生株和回补株相比,缺失株细胞壁肽聚糖层的结构更加松散、溶血能力下降、生物被膜形成能力下降、对不同类型抗生素的敏感性增强、抗氧化与抗酸能力均下降。上述结果表明pnp基因是SS2的一个重要调节因子,参与调节细菌对外界环境变化的适应能力。本研究为科学防控猪链球菌病以及研发新型抗菌药物奠定基础。

猪链球菌2型在感染兔体内的分布及其致病性研究

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病原体,猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)1954年首次在英国分离鉴定,在我国和其他养猪业发达的国家已多次流行,已成为危害我国养猪业和公共卫生安全的一个重要传染病。本研究用SS2-ZY05719株按10^(9)、10^(8)、10^(6)CFU腹腔注射途径人工感染健康的新西兰兔,3种剂量均可引起发病并死亡,新西兰兔临床症状明显,感染组平均体温升高1℃~2℃。同时分析了SS2在兔体各组织中的分布,结果显示,高剂量感染组出现明显的临床症状且快速死亡,感染剂量与发病程度有正相关性,对各试验组新西兰兔内脏组织进行检测发现,SS2主要集中在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑等组织中,不同组织器官中的细菌载量也存在着一定的差异,本文研究了SS2感染新西兰兔后的临床症状和各组织载菌量,为猪链球菌的防治及致病机理研究提供参考。

猪链球菌2型的主要毒力因子与先天性免疫逃逸机制

猪链球菌(SS)是一种重要的猪病病原体,能引起猪的高热、脑膜炎、败血症、关节炎和神经症状等。该菌有33个血清型,其中猪链球菌2型(SS2)流行最广、致病性最强,且存在感染人的风险,是一种重要的人兽共患病原菌,严重危害养猪业和公共卫生安全。目前已发现百余种SS2毒力因子,包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、溶血素、烯醇化酶、核酸酶、菌毛蛋白、H因子、透明质酸裂解酶、表面蛋白、超氧化物歧化酶和其他代谢和调节因子等。这些毒力因子不仅与致病性密切相关,还在细菌的定殖、入侵、传播和免疫逃逸过程发挥重要作用。先天性免疫应答是病原微生物入侵机体的第一道防线,可以非特异性识别并清除病原微生物。然而,SS2已经进化出多种逃避宿主防御的机制,如逃脱中性粒细胞胞外陷阱、逃逸补体反应、侵袭中枢神经系统、逃逸活性氧的杀伤作用、促进肽聚糖的N-脱乙酰化和逃逸自噬等。目前,SS2的防控多依赖于抗菌药物和疫苗免疫,了解SS2的免疫逃避机制对开发高效的疫苗和靶向药物具有重要意义。

优化培养基组分提高猪链球菌2型NT15B菌株活菌数的研究

【目的】以猪链球菌2型NT15B菌株为研究对象,通过优化发酵培养基组分提高菌株活菌数,降低生产成本,为猪链球菌2型NT15B菌株的高密度培养及猪链球菌病疫苗的大规模生产和推广提供参考。【方法】试验以培养的猪链球菌2型NT15B菌株最高活菌数为筛选指标,通过单因素试验筛选菌株发酵培养基中碳源、氮源(有机氮源和无机氮源)、无机盐金属离子、磷酸缓冲液的最佳组分及浓度,并根据单因素筛选结果选择碳源浓度、有机氮源总浓度、有机氮源比例、磷酸盐缓冲液浓度4个因素各3个水平设计正交试验,并进一步进行多因素的筛选与验证。【结果】猪链球菌2型NT15B菌株发酵培养基最优条件为6.0 g/L蔗糖、1.0 g/L尿素、10 g/L酵母提取物YE7与20 g/L酵母蛋白胨Nucel 887混合氮源,1.0 g/L NaCl、9.58 g/L K_(2)HPO_(4)·3H_(2)O、1.09 g/L KH_(2)PO_(4)、1 mmol/L MgSO_(4)·7H_(2)O、0.3 g/L L-抗坏血酸。采用此最优组合,摇瓶培养猪链球菌2型NT15B活菌数最高达80.83×10^(8)CFU/mL,较优化前提高256.08%。【结论】优化后的培养基能有效提高猪链球菌2型NT15B菌株活菌数,降低了生产成本,为发酵罐水平的优化提供参考。

致脑膜炎猪链球菌2型的分子分型鉴定及其生物学特性

旨在了解猪源致脑膜炎猪链球菌2型的分子分型和致病性及其生物学特性。本研究从患病猪的脑组织中分离到1株猪链球菌PX0923,通过电镜观察、16S rRNA基因测序、多重PCR、PCR-RFLP和多位点序列分析(MLST)等方法对其进行血清型和分子分型鉴定,毒力基因、生物被膜形成能力、耐药基因检测、小鼠感染试验、抗生素和中药药敏试验分析分离株PX0923的致病性和药物敏感性。结果表明,分离菌株PX0923为革兰阳性菌,电镜下可见连续排列成链状的卵圆形菌体;PCR和16S rRNA基因系统发育树分析确定其属于猪链球菌2型;序列分型为ST7,与ST1型猪链球菌聚为一支;携带epf+/mrp+/sly+/gapdh+/fbps+/orf2+/sao+7种毒力基因,呈现α型溶血活性;感染小鼠可导致小鼠肺、脾和肝等多个器官不同程度的病变,出现了小鼠脑膜炎等与病猪类似的临床症状;半数致死量(LD50)为1.08×10^(9)CFU/小鼠,提示PX0923可引起小鼠脑膜炎。分离菌株对庆大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星等12种药物耐药,携带耐药基因:aadA1和bla-TEM,对中药全蝎和三七敏感。本研究分离到猪源猪链球菌PX0923为血清2型,MLST分型为ST7,其携带多种毒力基因和耐药基因,感染小鼠可引起脑膜炎等多组织损伤;对多种抗生素和中药全蝎、三七敏感。研究结果为猪链球菌的流行和溯源分析提供了分子生物学基础,对致脑膜炎猪链球菌感染的防控提供参考依据。

基于响应面分析的高抗原活性猪链球菌2型疫苗培养基的研制与效果评价研究

试验旨在研制具有高抗原活性的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)疫苗培养基。研究以SS2 CVCC60615株为试验对象,通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面分析得到SS2疫苗培养基。培养基发酵验证结果显示,SS2疫苗培养基菌液最大活菌数为1.09×10^(9) CFU/mL,是TSB培养基最大活菌数的2.41倍。测定SS2不同时间点的抗原活性发现,在SS2发酵培养过程中当活菌数达到最大值后的1~3 h内细菌的抗原活性最高。小鼠感染试验表明,SS2抗原活性最高时制备的灭活疫苗与商品化灭活疫苗相比具有更高的免疫球蛋白G(IgG)抗体效价和疫苗保护率。研究表明,采用研制得到的高抗原活性SS2疫苗培养基制备的灭活疫苗具有IgG抗体效价高、免疫保护力强的优点。

血清2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C突变株致病力分析

目的对血清2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C的生物学功能进行生物信息学预测,并分析其对血清2型猪链球菌致病力的影响。方法利用生物信息学在线工具对Cps2C编码基因定位、蛋白保守结构域、跨膜结构域、蛋白相似性以及蛋白三维结构进行分析和预测。利用BALB/c小鼠感染模型,分别用野毒株05ZYH33和cps2C基因敲除株Δcps2C感染小鼠,对发病小鼠临床表征、小鼠死亡率、血液细菌载量进行比较分析。进一步对受感染小鼠的心脏、大脑和关节组织进行HE染色,对病理切片染色结果进行比较分析。结果Cps2C蛋白编码基因位于荚膜生物合成基因座cps上游,该蛋白无跨膜结构域,属于肺炎链球菌酪氨酸激酶CpsD同源蛋白,与其氨基酸序列相似性为64%,可能参与细菌荚膜合成调控。Cps2C缺失导致S.suis 2对小鼠的致病力显著减弱(P<0.05),与野毒株05ZYH33相比Δcps2C菌株的血液细菌含量降低(P<0.0001)。野毒株05ZYH33和Δcps2C菌株经腹腔注射感染的小鼠心脏、大脑和关节各组织结构完整,未见水肿、出血及炎症细胞浸润,未见心内膜炎、脑膜炎及关节炎等病变特征。结论血清2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C可能是荚膜生物合成的重要调节因子,Cps2C缺失导致细菌血液存活能力下降,对小鼠致病力降低。

猪链球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表达及催化特性分析

为了研究猪链球菌2型(SS2)核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的催化特性,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达猪链球菌2型RNaseⅢ(SS-RNaseⅢ)并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化。异源表达研究显示,重组蛋白RNaseⅢ大部分为可溶性表达;催化特性研究显示,RNaseⅢ主要依赖Mg^(2+)或Mn^(2+)发挥催化功能,并在不同离子浓度和pH值环境下具有不同的催化活性;底物特异性研究显示,RNaseⅢ特异性切割长度为30 bp的双链RNA,同时对内源性的rnc mRNA和5S rRNA具有良好的特异性。上述结果表明,相较于其他细菌RNaseⅢ,SS-RNaseⅢ具有独特的催化特性,为深入理解RNaseⅢ如何介导SS2致病机制奠定了基础。

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A^G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。

广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析

目的掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据。方法选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析。结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+、cps2J+/mrp+/sly-/gdh+/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/ef+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef-为病猪菌株所特有;MLST分型结果显示,22株分为ST1、ST7和ST28三个型别,其中ST1、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有。结论广东地区病人、病猪的猪链球菌2型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据。

检测猪链球菌2型的溶菌酶释放蛋白(MRP)的PCR方法的建立

根据猪链球菌 2型的mrp基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 885bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测溶菌酶释放蛋白 (MRP)的PCR方法。用XbaⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期一致的 5 78bp和 30 7bp的 2个片段。并进行了PCR的特异性试验和敏感性试验。对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的PCR检测结果均呈阴性 ;检测的敏感度可达 10 0个细菌。另外 ,对 9株从病猪体内分离的猪链球菌 2型菌株进行了检测 ,8株呈阳性 ;对 15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是 1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高 ,可作为MRP快速诊断和流行病学调查的手段。

猪链球菌2型上海分离株的病原特性鉴定

1997年底上海地区分离到一株猪链球菌 2型 ,结合培养特性、生化特性、血清定型及动物试验等对其进行了鉴定。其形态、染色及培养基本符合链球菌的特点 ,具有 β溶血。生化试验结果不稳定。用国际通用的链球菌A_G乳胶分型诊断液检测分离株 ,不在其检测范围。但能凝集猪链球菌 2型标准阳性血清。人工接种 4日龄乳鼠和猪有致病性。本试验对上海地区首次分离的猪链球菌 2型菌株进行了病原特性鉴定 ,证实猪链球菌 2型在上海存在 ,为今后防治猪链球菌病提供了可靠的科学依据。

四川资阳地区猪链球菌2型检测及其特性比较研究

目的对从四川省资阳及附近猪链球菌2型感染疫区采集的病料进行病原菌分离和特性比较研究。方法首先利用病原菌分离技术、多重定性PCR检测和荧光定量PCR检测技术进行病原菌的分离和鉴定;然后选取5株主要疫点代表菌株与1株国外参考菌株进行细菌药敏试验和实验动物腹腔接种感染试验;此外还对猪链球菌2型分离株基因组中的溶原性噬菌体进行了初步研究。结果(1)从采集的病料中分离到11株猪链球菌2型菌,都具有胞外因子(EF)和溶菌酶释放蛋白(MRP)两个特征性毒力因子;(2)6株试验菌株对氨苄青霉素、先锋必素、头胞克肟、乙酰螺旋霉素、万古霉素、复方新诺明和利福平等7种抗生素高度敏感。与国外参考菌株相比,资阳分离株具有链霉素抗性;(3)试验菌株对BALB/c鼠均具有一定的毒力,但毒力程度上有差异。资阳分离株449-1和国外参考株6#对鼠具有相同的强致死性(3/3死亡),资阳458分离株致死性较弱(0/3死亡),其它菌株具有中等强度的致死性。利用449-1、458和6#分离株进行家兔感染实验,各菌株均可引起家兔感染发病,死亡率分别是1/2、2/2和2/2;(4)国内首次获得了猪链球菌2型流行菌株匿藏着溶原性噬菌体的证据,该噬菌体与细菌毒力和适应性的关系有待深入研究。结论通过对资阳及附近地区猪链球菌2型分离株与国外分离株特性的比较研究,明确了流行菌株间在毒力和药物敏感性上存在着差异,细菌毒力差异表现为对动物种属的嗜性,并筛选出了猪链球菌病防治的可选择性药物。为进一步研究猪链球菌2型菌株的致病机理以及猪链球菌病的防治奠定了基础。

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因的克隆与鉴定

根据GenBank猪链球菌2型（SS2）报道序列．对江苏分离株SS2-H部分测序，发现位于已知毒力基因orf2与mrp之间存在两个新的开放阅读框序列。选取可能含有抗原决定簇肽段对应的核酸序列，该阅读框（2738～3694）编码319个氨基酸残基，分子量为33．5kDa，与已知任何基因无同源性。通过InterPro、PHD、DNAstar分析阅读框，并定向克隆至pET-32α（＋）载体中，转化至大肠杆菌BL21，表达出分子量为48kDa的融合蛋白，蛋白免疫转印可被SS2的抗血清识别，具有免疫原性；并且含有IMP dehydrogenase结构域，催化IMP生成XMP；流式细胞仪检测该蛋白可明显影响HEp-2细胞周期。

猪链球菌2型昆明鼠动物病理模型的建立

为研究猪链球菌2型的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,选用20~25 g健康昆明鼠,以猪链球菌2型山东株为病原,以腹腔注射为感染途径,对猪链球菌2型昆明鼠病理模型进行了探讨(试验随机分为5组,每组10只)。结果表明,感染鼠能表现出典型的临床症状及病理变化,具有较好的重复性,且临床症状及病理变化与本动物猪类似。剖检后从脑、肺,以及胸腔、腹腔和心包积液中都可以分离出猪链球菌2型,分离菌株生物学特性与攻毒菌株一致。按Reed-Munch法计算此菌株对昆明鼠的半数致死量为7×108cfu。感染后2周的血清平均抗体水平为1∶64。这说明昆明鼠能够很好地用作猪链球菌2型的动物病理模型。

猪链球菌2型四川分离株猪体回归试验

选用35～38日龄的健康断奶仔猪21头，分3组，用2005四川分离株SSsc0501分别经静脉、肌肉注射和口服3种途径感染，进行猪体回归试验。肌肉注射组（含菌0．6×10^8个／mL）16h开始出现症状，至36h全部死亡，发病率、病死率均为100％；静脉注射组（含菌0．2×10^8个／mL）25h开始出现症状，48h内全部死亡，发病率和病死率均为100％；口服攻毒组（含菌2×10^8个／mL）90h后开始有发病症状，第9天有1头死亡，发病率75％，病死率33％。从感染病死猪的肝脏、脾脏、肾脏、心血、大脑、脑脊液、淋巴结、肺脏和关节液中均分离到链球菌，经鉴定为试验攻毒的目的菌，表明猪体能够很好地用于猪链球菌2型动物感染模型，同时说明该菌侵害器官广泛，为进一步探讨该病的综合防制提供了重要技术依据。

猪链球菌2型福建分离株的主要毒力基因分析

目的为了解福建地区猪链球菌2型菌株毒力因子分布情况。方法选取谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)及毒力相关序列orf2等7个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计了7对引物,采用PCR方法,对本室分离保存的猪链球菌2型福建分离株的毒力基因进行分析。结果从屠宰生猪体内分离的4个猪链球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fb-ps+/orf2+,另1株从生猪体内分离的分离菌株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。结论福建地区生猪中猪链球菌2型至少有两种毒力基因型。

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。