猪防御素基因PBD-I在大肠杆菌中的重组和融合表达

用RT-PCR方法获得PBD I基因,将该基因插入原核表达载体PinPointTMXa-3中,重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达。SDS-PAGE电泳显示PBD I基因在目标位置17kDa处获得了表达。PBD I基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究形成基础。

猪防御素PD基因表达载体的构建

目的 -构建猪防御素PD基因表达载体。方法 -化学合成经过适当改造的带有双酶切位点的PD基因 ,将该基因定向插入带有相同酶切位点的融合表达质粒PinPoinTMXa 3的多克隆位点构建表达质粒。结果 -构建的表达载体经双酶切电泳分析及插入基因片断序列分析 ,表明PD基因表达载体构建成功。结论 -PD基因表达载体的构建 ,为进一步获得PD基因的表达产物 ,研究其抗菌活性、抗菌机理打下基础。

猪防御素PBD-1基因的克隆及其表达载体构建

将猪防御素基因PBD-1分成5段人工合成,然后再通过PCR方法将这5小段延伸成完整的PBD-1基因序列,并使其两端在合成后分别带上酶切位点和保护碱基。将该基因定向插入带有相同酶切位点的真核表达质粒pcDNA 3.1(+)的多克隆位点上构建表达质粒。重组质粒经双酶切电泳分析、序列鉴定,表明PBD-1基因表达载体构建成功,为进一步研究PBD-1基因表达产物的抗菌活性及其抗菌机理打下基础。

猪防御素基因pBD-2在大肠杆菌中的重组和融合表达

哺乳动物防御素是动物机体在抵御病原微生物的防御反应中产生的一类重要的抗菌肽物质,具有十分广泛的抗菌谱,在先天免疫上起重要作用。本研究根据已报道的pBD-2基因cDNA序列,合成了3条基因片段(1、2、3)。片段1、2和片段2、3各有15个碱基互补配对,PCR扩增延伸得到pBD-2基因,将pBD-2基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出pBD-2融合蛋白。pBD-2基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性打下了基础。

猪β-防御素-2在黄曲霉毒素B1致小鼠肠道炎症损伤中的作用

旨在探究猪β-防御素-2(pBD-2)在黄曲霉毒素B1(AFB1)致鼠肠道损伤中的作用。本试验以4周龄KM小鼠为研究对象,将体重相近的30只健康小鼠随机均分为5组,分别为空白对照组(不做任何处理)、DMSO组(1%DMSO灌胃)、AFB1组(0.3 mg/kg AFB1灌胃)、pBD-2组(0.03 mg/kg pBD-2灌胃)和AFB1+pBD-2组(0.3 mg/kg AFB1灌胃28 d后再用0.03 mg/kg pBD-2灌胃28 d),试验持续56 d,通过观察小鼠肠道结构的变化以及采用qPCR和免疫荧光的方法检测炎症相关因子的表达水平。结果:与对照组相比,AFB1组小鼠的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)均呈现显著下降趋势(P<0.05),料重比(F/G)降低,但差异不显著(P>0.05),而小鼠饲喂pBD-2以后ADG和ADFI均较AFB1组显著增加(P<0.05);HE染色结果显示,AFB1导致小鼠空肠黏膜显著损伤,并伴有严重的肠壁变薄,肠绒毛萎缩、稀疏,肠绒毛高度与隐窝深度之比、相对肠绒毛数量及肠壁厚度均显著降低(P<0.05),而使用pBD-2处理小鼠损伤模型,肠道结构可见显著恢复(P<0.05);qPCR和免疫荧光染色结果表明,AFB1处理小鼠可显著上调白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对白细胞介素-8(IL-8)的表达水平出现了下调趋势,而用pBD-2处理小鼠损伤模型后可显著下调炎症因子的表达水平,说明pBD-2对AFB1造成的肠黏膜炎症具有缓解作用。本研究结果为AFB1中毒的防控及pBD-2在畜牧生产中的应用提供了科学依据。

基于转录组分析猪β-防御素114在巨噬细胞中的免疫调节作用及机制

本试验旨在基于转录组研究猪β-防御素114(PBD114)在巨噬细胞中的免疫调节作用及机制。试验采用不同浓度(1~256μg/mL)的PBD114处理猪肺泡巨噬细胞3D4/21,并分别在1、3、6和12 h收集细胞培养液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)。为更加深入揭示PBD114在巨噬细胞中的免疫调节作用及机制,本试验通过转录组分析0(MOCK组)和100μg/mL PBD114(PBD114组)对培养12 h猪肺泡巨噬细胞3D4/21相关基因表达的影响,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果。结果表明:1)适宜浓度PBD114能够显著促进猪肺泡巨噬细胞3D4/21分泌TNF-α和IL-10(P<0.05),并且存在剂量依赖和时间效应。2)转录组测序表明,MOCK组和PBD114组共鉴定出1 894个差异表达基因(DEGs)。其中,与MOCK组相比,PBD114组CXC基序趋化因子配体2(CXCL2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、集落刺激因子3(CSF3)、白血病抑制因子(LIF)和白细胞介素-1α(IL-1α)等1 170个基因显著上调[差异倍数(FC)≥2,校正P值(adjusted P-value)≤0.001],B细胞淋巴瘤6β(Bcl6β)、B细胞淋巴瘤3(Bcl3)、CD2、CD4和CD83等724个基因显著下调(FC≥2,adjusted P-value≤0.001)。DEGs基因本体(GO)功能注释主要分布在分子功能、细胞组分和生物过程,DEGs数量分别是1 832、1 844和1 802个;京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路显著富集到95条(Q<0.05),其中肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、核因子-κB(NF-κB)信号通路、Toll样受体(TLR)信号通路和白细胞介素-17(IL-17)信号通路等信号通路参与免疫激活,DEGs数量分别是38、66、33、29和27个;蛋白质-蛋白质互作(PPI)和关键驱动分析(KDA)分析表明,RELB、TNF-α诱导蛋白3(TNFAIP3)和TNF受体相关因子1(TRAF1)等基因在PBD114调节巨噬细胞免疫中起着关键作用。3)qRT-PCR验证结果表明,8个随机选择的DEGs的表达趋势与转录组测序结果一致。由此可见,PBD114可以通过RELB、 TNFAIP3和TRAF1等关键基因,以及TNF、MAPK、NF-κB、TLR和IL-17等信号通路激活巨噬细胞免疫。

猪防御素的研究进展及其在饲料中的应用

防御素是一类富合半胱氨酸的阳离子活性多肽,是动物先天性免疫防御系统的重要组成部分,防御素在动物组织细胞中广泛表达,是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线。防御素具有的抗菌谱广、抗菌机制特殊、不易产生耐药性、残留低、对动物自身正常细胞没有伤害等特点,使防御素成为替代抗生素的最佳候选之一,未来将在畜禽生产中具有广阔的应用前景。本文主要对猪防御素基因的特点及其在动物组织中的表达谱、防御素在猪体内的表达调控特性、基因工程菌以及防御素在饲料业中的应用等方面进行阐述。

猪β防御素2胁迫下大肠杆菌内参基因的稳定性分析

以大肠杆菌的6个管家基因(recA,aspC,ldh,gapdh,mdh,16S rRNA)作为候选的内参基因,大肠杆菌在不同浓度猪β防御素2(0、37.5、75、150 mg·L-1)的胁迫下培养不同时间(1 h和4 h)后,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术比较这6个内参基因表达的稳定性,并通过GeNorm软件分析。结果表明,大肠杆菌中recA基因表达最稳定,其次是aspC和gapdh。并且16S rRNA的相对表达量最高,而ldh的表达量最低。

猪β防御素-1的研究进展

猪β防御素-1(porcineβ-defensin 1,PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中有着重要的作用,大量研究结果证明PBD-1具有独特的作用机制,几乎无耐药性,已引起各国研究者的日益重视。目前对PBD-1科研工作在不断深入,可以相信PBD-1将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质方面发挥重要作用。作者就PBD-1的分布、分子结构、抗菌作用机制和基因表达调控研究进展作一综述。

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。

重组猪β-防御素1对大肠杆菌的抑制作用

旨在评价重组猪β-防御素1(porcineβ-defensin 1,pBD1)对大肠杆菌(E.coli)的体外抑制活性及其对大肠杆菌病鸡的治疗效果。应用琼脂板打孔扩散法和微量抑菌试验,分别测定重组pBD1对3株E.coli(O141、SJZ1和SJZ2株)的体外抑制效果,继而将40只11d的雏鸡随机分为5组(n=8),即A(防御素)组、B(抗生素)组、C(防御素与抗生素联合治疗)组、D(感染非治疗)组和E(空白对照)组。A、B、C和D组:同时经颈部皮下和口服途径分别给每只鸡接种1mL E.coli O141株(1.25×109 cfu·mL^(-1));E组:以同样途径分别给每只鸡接种1mL肉汤。当感染鸡表现临床症状时,A、B、C和D组分别口服pBD1[50μg·(只·次)^(-1)]、头孢曲松钠(50mg·kg^(-1),按体重给药,下同)、pBD1和头孢曲松钠[分别为50μg·(只·次)-1和50mg·kg^(-1)]及等体积的无菌生理盐水,每天1次,连续治疗7d。结果表明,重组pBD1在体外对3株E.coli均具有明显的抑制活性,抑菌效果随浓度增加而增强。与非治疗组相比,三个治疗组的临床症状和病理变化明显减轻,发病率、死亡率降低,感染后期防御素治疗组、防御素与抗生素联合治疗组的体重极显著高于感染非治疗组(P<0.01)。以上结果显示,重组pBD1对E.coli生长具有明显抑制作用,对大肠杆菌病鸡具有良好的治疗效果;重组pBD1的治疗效果优于头孢曲松钠,有助于病鸡恢复;当pBD1与头孢曲松钠联合使用时,疗效更佳。该研究结果可以为大肠杆菌病的有效治疗提供科学依据,为新型抗菌制剂pBD1的研究与开发奠定重要基础。

乳铁蛋白对大河乌猪繁殖性能及母猪与仔猪铁营养、血细胞参数、免疫指标和猪β防御素基因表达的影响

本试验旨在研究乳铁蛋白(LF)对大河乌猪繁殖性能及母猪与仔猪铁营养、血细胞参数、免疫指标和猪β防御素(pBD)基因表达的影响。选用经产(3~4胎)、产仔数和体重相近的大河乌猪母猪60头,随机分为5组,每组12个重复,每重复1头母猪。从妊娠第80天至分娩,对照组饲喂基础饲粮,LF1组、LF2组、LF3组分别在基础饲粮中添加100、200、300 mg/kg LF,甘氨酸螯合铁(Fe-Gly)组在基础饲粮中添加500 mg/kg Fe-Gly。考察母猪繁殖性能,检测母猪和仔猪血液红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)含量、血清免疫指标以及母猪血清和乳汁铁含量,并检测仔猪肝脏、脾脏和十二指肠pBD基因表达量。结果表明:1)与对照组相比,LF2组仔猪初生重及初生窝重显著提高(P<0.05),LF1和LF3组仔猪初生窝重显著提高(P<0.05)。2)与对照组相比,LF2、LF3和Fe-Gly组母猪血液RBC及HGB含量显著提高(P<0.05),LF1、LF2、LF3和Fe-Gly组仔猪血液RBC及HGB含量显著提高(P<0.05)。3)与对照组相比,LF1、LF2和LF3组母猪血清和乳汁铁含量显著提高(P<0.05)。4)与对照组相比,LF1、LF2和LF3和Fe-Gly组仔猪血清乳酸脱氢酶(LDH)活性显著降低(P<0.05),血清一氧化氮合酶(NOS)活性显著提高(P<0.05);LF1、LF2组仔猪血清免疫球蛋白G(IgG)含量和溶菌酶(LSZ)活性显著提高(P<0.05)。5)与对照组相比,LF2组仔猪肝脏、脾脏、十二指肠pBD-1基因,肝脏、脾脏pBD-2基因以及脾脏pBD-3基因表达量显著提高(P<0.05);LF1组仔猪肝脏pBD-1、pBD-2基因以及LF3组仔猪肝脏、脾脏pBD-1基因表达量显著提高(P<0.05);LF1、LF2、LF3和Fe-Gly组仔猪十二指肠pBD-2基因以及肝脏、十二指肠pBD-3基因表达量显著降低(P<0.05)。由此可见,在大河乌猪妊娠后期饲粮中添加适宜剂量(200 mg/kg)LF可提高仔猪初生重及初生窝重,改善仔猪铁营养和提高血清免疫指标,增加仔猪肝脏、脾脏和十二指肠pBD-1基因表达量,有利于提高仔猪的抗病能力。

猪β防御素研究进展

β防御素是猪体内分泌的一类抗菌肽,广泛分布于各个组织中,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用。猪β防御素对细菌、真菌和病毒都有很强的杀灭作用,并且具有分子量小、热稳定性好、无残留等优点,是理想的抗生素替代品。研究表明,猪β防御素的表达与个体抗病力正相关,增加内源性防御素表达或直接摄入外源性防御素均能增强机体免疫力并促进生长。脂肪酸、氨基酸、维生素、益生菌、病原微生物等外源刺激皆可影响β防御素的表达。随着防御素相关研究的深入,将有望解决养猪生产中长期使用抗生素而导致的耐药性、药物残留及环境污染等问题。文章介绍了猪β防御素的结构特征、表达特异性及生物学功能,主要综述了外源刺激对β防御素表达的影响及其作用机制,初步说明外源β防御素作为饲料添加剂在仔猪生产中的效果,旨在为猪β防御素的深入研究及其在生猪健康养殖中的应用提供参考。

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。

猪β-防御素的表达及其生物学功能研究进展

猪β-防御素是一种先天免疫小分子蛋白质,在宿主防御中起着重要作用。它们不仅具有抗细菌和病毒的活性,还能通过连接先天性免疫和适应性免疫来调节免疫功能,抵抗病原体的感染。基于猪β-防御素的抗微生物活性及其免疫调节功能,其既可以作为提高免疫力的内在潜力,也可以开发成外源应用的抗生素替代品。本文将综述猪β-防御素的表达与分布、表达调控、生物学功能及其异源表达。

猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达

【目的】猪β-防御素(β-defensin)是猪自身分泌的一种能够杀菌、调节免疫功能的小分子抗菌肽,是猪生长繁殖不可缺少的蛋白质。【方法】根据NCBI数据库中的猪防御素cDNA序列,人工合成该基因序列,同时引入相关调控序列及适当酶切位点。酶切该人工合成的DNA后,连接到表达载体p HT43中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得的转化子用于筛选重组表达质粒。将获得的重组表达质粒p HT43-SS-BD转化到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N中,获得基因工程菌株。使用蔗糖诱导基因工程菌表达猪β-防御素,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,抑菌试验测定其抑菌活性。【结果】SDS-PAGE电泳结果显示在蔗糖诱导后得到约5 KDa的目的蛋白条带;平板抑菌试验结果表明,蔗糖诱导后的上清液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果,而没加蔗糖的对照组上清液无抑菌效果。【结论】该研究实现猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为解决抗菌肽来源限制及枯草芽孢杆菌的生产应用奠定了技术基础。

猪β防御素-2对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内外抑菌活性研究

本研究旨在评价猪β防御素2(porcine beta defensin 2,PBD-2)在体内外对猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的抗菌效果,为评估PBD-2在抗生素替代品中的应用前景提供参考。首先,在体外检测不同浓度PBD-2对猪源ExPEC PCN033的杀菌活性。随后,选取5周龄,体重在18~22 g之间的雌性昆明小鼠,检测PBD-2处理组和PBS对照组小鼠(n≥5)感染不同剂量的ExPEC PCN033后的存活率,脑、脾脏、肺脏组织和血液中的载菌量、炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平及脑、脾脏、肺脏组织的病理变化程度。结果表明,PBD-2在25μg/mL时即可在体外极显著抑制猪源ExPEC PCN033的生长(P<0.01),且抑制作用随PBD-2的浓度升高而增强。在体内,与PBS对照组相比,PBD-2处理有效降低了小鼠感染不同剂量ExPEC PCN033后的死亡率。提高PBD-2的治疗剂量对降低小鼠死亡率的效果更加明显。腹腔注射和肌内注射的方式在PBD-2降低小鼠死亡率的效果方面优于口服途径。PBD-2治疗在降低小鼠死亡率的效果方面略低于氯霉素治疗。同时,PBD-2治疗极显著降低了小鼠感染ExPEC PCN03321 h后的脑、脾脏、肺脏组织和血液中的细菌载量(P<0.01),降低了血液中的IL-6、IL-12和IL-1β的含量(P<0.01),减轻了脑、脾脏和肺脏组织的病变程度。上述结果说明PBD-2在体外具有良好的抗猪源ExPEC的活性,同时在小鼠体内对猪源ExPEC感染具有治疗作用,表明PBD-2具有开发成为治疗性药物或者抗生素替代品的潜力。

猪β防御素-2对猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

防御素是一种广泛分布于动植物中的阳离子小肽,是哺乳动物先天性免疫防御系统的重要成分,具有广谱抗菌、抗病毒和抗真菌活性。猪β防御素-2(porcineβ-defensin-2,PBD-2)是猪表达的天然防御素之一,在体外具有良好的抗菌活性。本研究旨在评价PBD-2在动物体内对重要的人兽共患病原菌猪链球菌感染的治疗效果,为评估PBD-2成为治疗性药物的潜在价值提供依据。首先,在体外检测了PBD-2对猪链球菌临床分离菌株SC-19的杀菌活性,并且在鼠源巨噬细胞(RAW264.7)上检测了PBD-2的细胞毒性。随后,选取4~6周龄,体重在18~22 g的C57雌鼠,检测了PBD-2处理组和PBS对照组小鼠(n≥6)感染猪链球菌SC-19后的存活率、组织载菌量、炎性细胞因子水平和病理变化。结果表明,PBD-2(25~200μg·mL-1)可显著地抑制猪链球菌SC-19生长(P<0.05),且抑制作用随浓度升高而增强,同时,对RAW细胞无显著的毒性作用(P>0.05)。在体内,PBD-2处理能有效降低小鼠感染猪链球菌SC-19后的死亡率,并且显著降低小鼠感染细菌后的脑、肺、脾组织和血液中的细菌载量,以及血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的水平(P<0.05)。同时,PBD-2治疗也显著降低了小鼠感染细菌后肺和脾组织的病理变化程度(P<0.05)。这些结果说明,PBD-2在体外具有良好的抗猪链球菌的活性,无显著细胞毒性,同时,在小鼠体内对猪链球菌感染具有治疗效果,提示,PBD-2具有进一步开发为治疗性药物的潜力。

猪源β-防御素2和3的研究进展

防御素是一类阳离子抗菌肽,广泛存在于动物和植物体内。猪源β-防御素2和β-防御素3能抵抗猪体内病原微生物,并能调节机体免疫功能,对生殖发育也有一定的生理作用。猪源β-防御素2能促进仔猪生长,对猪红细胞毒性低,能在毕赤酵母中高效表达,其转基因猪也具有较好的抗病性能。因此,猪防御素具有潜在的应用价值。本文就猪源β-防御素2和β-防御素3在体内的表达分布和调控因素、参与调节的信号通路、在生殖发育和畜牧养殖方面的新功能及应用潜力进行综述。

猪β防御素3表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上发表的猪β防御素3(pBD3)基因的序列,通过生物学软件预测其成熟肽序列。提取猪舌组织RNA,设计引物,通过PCR的方法扩增得到约150bp的pBD3成熟肽基因序列,构建其原核表达载体pET-pBD3,并获得工程菌株BL21-pET-pBD3。IPTG诱导表达后,比对照多表达了1条约16kD的蛋白条带,通过免疫蛋白印记说明所表达的蛋白为带有His·Tag的融合蛋白,证明pBD3成功表达。