猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌的分离与鉴定以及PCR检测方法的建立

[目的]为了确定四川省某猪场初生仔猪大规模发病的原因。[方法]对发病仔猪进行细菌分离、培养特性及形态结构观察、生化鉴定、药敏试验、动物致病性试验和血清型鉴定,并建立PCR快速检测方法。[结果]从发病仔猪体内分离到1株优势菌,初步鉴定为沙门氏菌。根据沙门氏菌invB基因设计的1对引物进行PCR扩增,得到408bp的特异性条带,PCR产物经T-A克隆测序证实为invB基因,与参比序列具有非常高的同源性,说明该PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。经血清学试验确定该分离株为猪霍乱沙门氏菌,毒力试验和药敏试验结果表明分离菌致病性很强,对头孢三嗪、氯霉素、氧氟沙星等敏感。[结论]该研究为沙门氏菌病原鉴定与疾病诊断提供了依据。

规模化猪场猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验

采集新乡市某规模化猪场疑似猪沙门氏菌病的病料,通过细菌分离培养、生化鉴定、动物试验和药敏试验,分离到1株革兰氏阴性小杆菌,该菌在麦康凯琼脂平板上呈细小、无色半透明、光滑、圆整的菌落,对葡萄糖、木糖醇、赖氨酸、甘露醇、蔗糖、果糖和山梨醇反应阳性,对甘露糖、硫化氢、苯丙氨酸、尿素酶反应呈阴性,可致死小白鼠,确定所分离的细菌为猪霍乱沙门氏菌。该菌对头孢噻呋、左旋氧氟沙星等敏感,对诺氟沙星和新霉素中介,对氟苯尼考、氨苄西林、庆大霉素等耐药。该研究为猪沙门氏菌病的防治提供理论依据。

基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法检测猪霍乱沙门氏菌

建立了基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法,检测猪霍乱沙门氏菌。待检样品经免疫磁分离富集和热洗脱处理后,用荧光微球免疫层析试纸条进行检测。每毫克纳米磁珠标记30μg抗体制备的免疫磁珠,对浓度为10~2~10~6CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌的捕获率均大于90%,特异性好;在pH=6时,以300μg/mg猪霍乱沙门氏菌单抗11D8-D4标记荧光微球,制备免疫荧光微球;以2.0 mg/mL猪霍乱沙门氏菌单抗5F11-B11喷涂检测线(T线),以1.0 mg/mL驴抗鼠IgG喷涂质控线(C线),制备免疫层析试纸条。采用建立的基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析方法检测猪霍乱沙门氏菌,在PBS缓冲液中检出限为1.5×10~5CFU/mL,牛奶中检出限为7.6×10~5CFU/mL,与直接采用荧光微球免疫层析方法检测相比,检出限分别降低了10倍和200倍。本方法可有效富集牛奶中的沙门氏菌,避免了基质干扰,灵敏度大大提高,具有较好的应用前景。

猪霍乱沙门氏菌的快速分离鉴定

猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原菌,给养猪业造成重大危害。本文旨在建立一套细菌快速分离鉴定方法,为该病流行病学调查提供有效手段。从临床初诊为仔猪副伤寒的病猪采集粪便,接种亚硒酸盐亮绿增菌液增菌后,划线于SS琼脂培养基,挑无色透明菌落纯化。纯化菌落用美国B IOLOG自动细菌鉴定仪GN2肠杆菌鉴定板鉴定,同时用常规生化鉴定管鉴定,结果符合猪霍乱沙门氏菌的生化特征。PCR扩增invA基因,测序鉴定PCR产物,结果与猪霍乱沙门氏菌参考序列同源性达99%以上。分离菌株接种小白鼠,证明其对小白鼠有致病性。用沙门氏菌属标准血清检测证实其抗原式为6,7∶c∶1,5,符合猪霍乱沙门氏菌的抗原特征。应用以上方法从全国各地病料中分离鉴定了40多株猪霍乱沙门氏菌,为猪霍乱沙门氏菌病的流行病学调查提供了依据,同时证明该方法切实可行。

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌LAMP检测方法的建立与应用

利用猪霍乱沙门氏菌lac Z基因设计特异性引物,通过优化各种反应条件,建立了检测猪霍乱沙门氏菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。此方法特异性好,灵敏度高,将细菌DNA稀释到10-8仍可检出,是PCR方法的1000倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强,为临床检测猪霍乱沙门氏菌和预防人猪霍乱沙门氏菌病提供了技术保障。

两株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪霍乱沙门氏菌的分离及人工共感染猪的致病性试验

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与细菌混合感染的情况,本研究采用RT-PCR方法对不同猪场采集的样品进行PRRSV检测,并进一步对PRRSV阳性样品进行细菌培养分离,经BIOLOG细菌鉴定仪鉴定,分离培养的细菌为猪霍乱沙门氏菌(S.cholersuis)。利用分离获得的2株PRRSV和一株S.cholersuis进行动物回归试验,结果表明所有人工感染猪在感染后的第5 d出现病毒血症;2份PRRSV分离株单独人工感染的发病率均为100%,死亡率分别为55.6%和100%;PRRSV与S.cholersuis共感染的动物死亡率均为100%。与单独的PRRSV感染组相比,PRRSV与S.cholersuis共感染后实验动物的发病和死亡时间大大缩短,进一步表明其混合感染具有协同致病性,导致发病率和死亡率的上升。

樱桃谷鸭感染猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

某地樱桃谷鸭群发生一种高发病率、高死亡率的传染病 ,其临床表现为沉郁、不食、下痢、脚软、发热等 ,病变特征以内脏器官充血、出血为主。本文从鸭体内分离到 2株细菌 ,经鉴定为猪霍乱沙门氏菌 ;并进行了毒力试验和药敏试验 ,结果 2菌致病性均很强 ,对氯霉素、卡那霉素。

蓝狐猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

某蓝狐场２只成狐于１９９６年１１月先后发病，临床症状为呕吐、腹泻、眼有脓性分泌物，病程分别为７和１２天，病理变化主要为杆脏、脾脏、淋巴结肿大，有小坏死灶。作者从脾脏和淋巴结中分离出２株猪霍乱沙门氏菌，且证明２株菌有较强的致病性。

慢性乙型肝炎合并猪霍乱沙门氏菌感染1例

非伤寒沙门氏菌感染是指伤寒、副伤寒以外的沙门氏菌引起的急性感染性疾病，通称为沙门氏菌感染。近十余年来，沙门氏菌感染明显增加，并多见于婴幼儿^[1,2]。其临床表现复杂，可分为胃肠炎型、类伤寒型、败血症型、局部化脓感染型，亦可表现为无症状感染。猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）是非伤寒沙门菌的一种，有关成人慢性乙型肝炎患者感染猪霍乱沙门氏菌所致临床疾病的报道鲜见。我们收治1例慢性乙型肝炎患者，在抗病毒治疗过程中出现间断性高热，经血培养证实为猪霍乱沙门氏菌感染，并成功治愈，现报告如下。

2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp^-/asd^-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。

鹧鸪猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

1999年 6月 ,某饲养场 9日龄鹧鸪发生大批死亡 ,临床表现为不食、呆立、羽毛松乱、腹泻 ;病理变化主要表现为肝呈土黄色、出血、并有坏死灶。从肝、脾分离出 4株猪霍乱沙门氏菌 (Salmonellacholeraesuis) 。

草鱼片猪霍乱沙门氏菌生长的控制

为了有效控制生鱼片等生食食品携带致病菌的生长,比较了物理(超高压)、化学(双氧水)和生物(蛭弧菌BDM01)三种方法对草鱼片上接种的猪霍乱沙门氏菌进行消除和控制的效果,并对被处理鱼片进行了感官评定。结果表明,与对照组相比,三种方法对草鱼片猪霍乱沙门氏菌均有很好的控制作用(p<0.05);且蛭弧菌控制猪霍乱沙门氏菌的生物方法优于超高压和双氧水的物理、化学方法。与其他两种方法相比,蛭弧菌M01处理鱼片的生物方法能在较长时间内(48h)控制草鱼片猪霍乱沙门氏菌的增长,保持鱼片良好的感官状态。虽然在25℃保存/保鲜期间,生物处理组的猪霍乱沙门氏菌的初始浓度高于其他两种方法的处理组,但其增长受到更大的控制。结果表明,在受低度污染的鱼片保鲜中,蛭弧菌技术具有潜在的应用价值。

猪霍乱沙门氏菌C79102株的制备与检定

为研究猪霍乱沙门氏菌C79102株的菌种特性,制备了一批猪霍乱沙门氏菌C79102株,并对菌种的真空度、纯粹、剩余水分、培养特性、形态及生化特性、血清学特性、特异性、毒力等进行检定,重点对菌种的毒力进行研究。试验结果表明,该冻干菌种的真空度、纯粹、剩余水分、培养特性、形态及生化特性、血清学特性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版质量标准的规定,特异性检验结果显示C79102在含1%醋酸铊的普通肉汤中不生长,毒力试验结果显示,不同制备方法获得的肉肝胃消化汤培养的菌液毒力差异明显。本研究可以为猪霍乱沙门氏菌的制备和检定提供参考依据。

减毒猪霍乱沙门氏菌作为疫苗及载体的研究进展

猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原之一,同时也是食物中毒的重要病原,因此在养殖业和公共卫生上均有重要意义。本文就其疫苗及疫苗作为载体的研究进展作一综述。

人猪霍乱沙门氏菌败血症1例

1资料与方法 我院于2007年6月8日诊断和治疗1例猪霍乱沙门氏菌败血症，现报告如下。

八株猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定及豚鼠免疫模型的建立

2006年9月-2008年9月从上海及周边地区（江苏太仓、浙江嘉善等地）发病猪场分离到各种病原菌70余株，其中8株经BIOLOG鉴定系统、血清学试验鉴定为猪霍乱沙门氏菌（S．cholerasuis），其中080106#分离株，1亿-3亿个菌／mL和3亿～5亿个菌／mL的攻毒剂量能分别致死小鼠、豚鼠和枫泾猪，表明该菌株的致病力较强。

crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。