crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp^-/asd^-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。

减毒猪霍乱沙门氏菌C500抗冻保护剂的优化研究

本试验旨在优化减毒猪霍乱沙门氏菌C500抗冻保护剂,提高工程菌C500的存活率。通过单因素试验考察了4种类型的抗冻保护剂(渗透性、半渗透性、非渗透性保护剂及抗氧化剂)对工程菌C500冷冻保存前后存活率的影响,各保护剂设置不同的浓度并与工程菌C500等体积混合,于液氮中保存2周后进行平板计数以计算其成活率,初步筛选出最有利于菌种保存的渗透性保护剂、半渗透性保护剂、非渗透性保护剂和抗氧化剂及其最佳保护浓度,最后将筛选出的4种保护剂进行四因素三水平的正交试验以得出最佳的组合配方。单因素试验的结果表明,渗透性保护剂中乙二醇、半渗透性保护剂中蔗糖、非渗透性保护剂中聚乙烯吡络烷酮(PVP)及抗氧化剂中甘氨酸对工程菌C500的保护作用最佳,最佳保存浓度分别为15%、6%、6%和0.25%;正交试验结果表明,各因素均对工程菌C500的存活率有显著影响,筛选出的最佳组合配方为17%乙二醇、9.0%蔗糖、6.0%PVP、0.35%甘氨酸,最佳组合在-80℃的保存效果最佳,此温度下保存6周存活率可达88.34%,其次为液氮组、-20℃组及4℃组。这表明本试验得到的保护剂配方极大地提高了工程菌C500的抗冻能力,使其存活率大大提高。

猪霍乱沙门氏菌C79102株的制备与检定

为研究猪霍乱沙门氏菌C79102株的菌种特性,制备了一批猪霍乱沙门氏菌C79102株,并对菌种的真空度、纯粹、剩余水分、培养特性、形态及生化特性、血清学特性、特异性、毒力等进行检定,重点对菌种的毒力进行研究。试验结果表明,该冻干菌种的真空度、纯粹、剩余水分、培养特性、形态及生化特性、血清学特性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版质量标准的规定,特异性检验结果显示C79102在含1%醋酸铊的普通肉汤中不生长,毒力试验结果显示,不同制备方法获得的肉肝胃消化汤培养的菌液毒力差异明显。本研究可以为猪霍乱沙门氏菌的制备和检定提供参考依据。

表达T^+Pm保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及其生物学特性

【目的】本研究利用Asd+平衡致死系统构建表达巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)的重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌株的生物学特性进行比较研究。【方法和结果】通过基因克隆的方法构建表达PMT的重组质粒pYA-PmtC,再将其电转化减毒猪霍乱沙门氏菌C500的asd基因缺失株C501,构建口服活疫苗菌株C501(pYA-PmtC)。研究结果表明重组菌株C501(pYA-PmtC)的生化特性、血清型和生长速度与亲本菌株C500一致;在没有选择压力的条件下,C501(pYA-PmtC)能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段,并能稳定、高效、分泌性表达30.5kDa的外源保护性抗原rPmtC。C501(pYA-PmtC)腹腔感染BALB/c小鼠的LD50为8.5×106CFU,毒力稍低于C500(LD50为4.4×106CFU);口服接种C501(pYA-PmtC)和C500的所有仔猪未见任何发病症状,两者没有显著差别。【结论】本研究利用Asd+平衡致死系统的原理构建表达T+Pm保护性抗原重组猪霍乱沙门氏菌弱毒菌株C501(pYA-PmtC),为进一步开发猪萎缩性鼻炎-副伤寒的双价基因工程疫苗奠定基础。

猪瘟兔化弱毒疫苗(C株):历史、现状和未来

猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)是中国老一辈科学家在20世纪50年代创制的一株举世闻名的猪瘟疫苗.该疫苗对中国乃至世界范围内猪瘟的防控发挥了举足轻重的作用,具有重要影响[1].目前,该疫苗仍在广泛应用.猪瘟(classical swine fever,CSF)过去称为猪霍乱,是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的严重危害养猪业的重要疫病,是世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health,WOAH)规定的须申报的疫病[2].该病以发病急、持续高热、全身广泛性出血和白细胞减少为主要特征,发病率和死亡率高.猪(包括家猪和野猪)是唯一的易感宿主[3].

仔猪副伤寒活疫苗生产菌种的保存期试验

对不同年代冻干制备 ,在 2～ 8℃保存的 3批猪霍乱沙门氏菌 C50 0弱毒菌株 ,依据 1 992年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》[1]进行了系统鉴定 ,结果表明 C50 0冻干菌种在 2～ 8℃保存 31年、1 9年和 1 3年 ,菌种的各项特性均符合规程规定的标准。