猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。

猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的构建及其生物学特性比较

为开发更加安全有效且遗传背景清晰的减毒猪霍乱沙门菌活疫苗,运用自杀性质粒介导的等位交换技术缺失cya基因,分别构建猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1,并将两者的生物学特性与ΔcrpC78-1和疫苗株C500进行比较。以猪霍乱沙门菌C78-1为模板,分别扩增cya基因的上臂和下臂,然后通过中间转移载体pBluescriptⅡSK(+)克隆至自杀性质粒pRE112中,构建重组自杀性质粒pREΔcya,再与C78-1和ΔcrpC78-1分别进行接合转移,通过两步法筛选ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1。PCR及测序结果表明,ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1构建成功。生物学特性检测结果表明,所构建的ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的血清型和生化特性与ΔcrpC78-1保持一致,并能够稳定遗传Δcya基因;两者的生长速度明显慢于疫苗株C500,且ΔcrpΔcyaC78-1的生长速度最慢。小鼠毒力试验表明,ΔcyaC78-1的毒力高于ΔcrpC78-1约1.7倍,较疫苗菌株C500下降至58.2%,但ΔcrpΔcyaC78-1的毒力较ΔcrpC78-1下降至0.194%,较C500下降至0.065%。构建的猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaC78-1遗传稳定,背景清晰,毒力降低,尤其是ΔcrpΔcyaC78-1双缺失株的毒力较疫苗株C500降低显著,为筛选更加高效的减毒猪霍乱沙门菌疫苗和进一步开发适用于猪的口服活疫苗载体奠定了良好基础。

不同浓度血管紧张素(1-7)对心肌肥厚所致内质网应激损伤的保护作用

目的观察血管紧张素(1-7)对心肌肥厚内质网应激所致细胞损伤的保护作用。方法实验分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ组、血管紧张素(1-7)干预组。体外培养乳鼠心肌细胞,用不同浓度血管紧张素Ⅱ(100 nmol/L、1000 nmol/L)分别作用24 h、48 h、72 h诱导其肥厚。用不同浓度的血管紧张素(1-7)(10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L)进行干预。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态变化。考马斯亮蓝G-250法测定心肌总蛋白合成。RT-PCR和W estern B lotting检测内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白的表达。结果与空白对照组相比,100 nmol/L血管紧张素Ⅱ干预24 h可诱导心肌肥厚,心肌细胞体积增大,细胞蛋白含量增加(1.59±0.03 g/L,P<0.05),葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05),给予血管紧张素(1-7)干预后,可较大程度地逆转上述指标变化(P<0.05)。结论血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥厚存在内质网应激。血管紧张素(1-7)可以通过减轻内质网应激来减轻心肌细胞肥厚,对心肌细胞具有保护作用且1000 nmol/L血管紧张素(1-7)的保护作用最强。

β_1-肾上腺素受体自身抗体通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡

目的:探讨内质网应激在β_1-肾上腺素受体自身抗体(β_1-AA)引起心肌细胞凋亡中的作用。方法:采用β_1-肾上腺素受体细胞外第二环抗原肽段主动免疫大鼠,应用SA-ELISA法检测大鼠血清中β_1-AA的水平,TUNEL染色检测心肌组织的凋亡水平,Western blot法和免疫组化法检测心肌组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12的蛋白表达。利用亲和层析法纯化的β_1-AA处理H9c2心肌细胞,CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡;采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理H9c2心肌细胞,再给予β_1-AA干预,CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡的变化情况。结果:与对照组相比,主动免疫大鼠血清中β_1-AA水平在免疫2周时显著增加,进一步增加至8周,并且主动免疫2周大鼠心肌组织凋亡率明显升高,持续升高至8周。与对照组相比,主动免疫大鼠心肌组织中GRP78、CHOP及caspase-12的蛋白表达在免疫4周和8周时均明显增加。β_1-AA引起H9c2心肌细胞活力持续降低,凋亡明显增加。与β_1-AA单独处理组相比,内质网应激抑制剂4-PBA预处理H9c2心肌细胞可以有效逆转β_1-AA诱导的细胞凋亡增加和活力下降。结论:β_1-AA可以通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡。

Ang1-7通过抑制内质网应激减轻高血压大鼠心肌肥厚

目的探讨血管紧张素1-7(angiotensin1-7,Ang1-7)对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat,SHR)心肌肥厚的影响及其相关机制。方法将5只16周龄Wistar-kyoto(WKY)大鼠作正常对照组(normal control,NC),10只16周龄SHR分为药物干预组(Ang1-7+SHR,AS)和安慰剂对照组(normal+SHR,NS),每组5只。AS组按400 ng·(kg·min)^(-1)的剂量皮下微渗泵连续注射Ang1-7,持续给药4周;NS组按相同容积泵速皮下微渗泵注射0.9%NaCl,持续给药4周;NC组不做任何处理。于干预结束后测量并观察血压水平变化,超声心动图检测舒张期室间隔厚度(diastolic interventricular septum,IVSd)判断心肌肥厚程度,行HE染色、Masson染色分别观察心肌细胞形态及纤维化,免疫组化检测心肌细胞葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白质(CHOP)的表达。结果干预后,与NC组比较,NS组、AS组血压均升高(P均<0.01);AS组血压较NS组降低(P<0.01)。NS组IVSd较NC组增大(P<0.05),AS组IVSd较NS组减小(P<0.05)。与NC组相比,NS组GRP78和CHOP蛋白相对表达量均增多(P均<0.05)。AS组GRP78和CHOP蛋白相对表达量均较NS组减少(P均<0.05)。同时形态学观察到AS组较NS组心肌细胞肥大程度以及纤维化均减轻。结论Ang1-7能降低SHR血压水平,减轻心肌细胞受损,缓解心肌肥厚,其作用机制可能与降低心肌细胞内质网应激相关因子GRP78、CHOP的表达水平有关。

猪霍乱沙门氏菌递送的双启动子表达载体的构建

猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗,还可作为运送其他DNA疫苗的优良载体,并通过粘膜免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。为增强其携带的DNA疫苗的免疫效力,本研究以真核表达载体pEGFP-C1为基础,将其真核启动子CMVie与原核启动子Ptrc串联,并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列,构建了真、原核双启动子表达载体pEGFPPtrcR。用1×TSS法将其转化C500,得到工程菌C500/pEGFPPtrcR,通过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定了报告基因EGFP的原核表达,该菌在荧光显微镜下能发出强烈绿色荧光,被证明在体外至少能稳定遗传20代;采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR转染Vero细胞,EGFP在胞核和胞浆内表达,24h后观察可到明显绿色荧光。结果表明,双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功,预示其携带的外源基因既可在C500中表达,又可在体细胞中表达,为研制以C500为载体的新型DNA疫苗的发展开辟了一个新的途径。

叶酸对铅诱导的大鼠肺脏中氧化应激相关蛋白和内质网应激相关蛋白表达的影响

本试验旨在研究叶酸对铅诱导的大鼠肺脏中氧化应激相关蛋白核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)与内质网应激相关蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响,探讨叶酸对铅暴露导致的肺脏损伤的干预作用。将32只成年无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠按体重一致原则平均分成4组(n=8):对照组(C组,自由饮水+1 mL去离子水灌胃)、染铅组(L组,自由饮0.2%的醋酸铅溶液+1 mL去离子水灌胃)、干预组(I组,自由饮0.2%的醋酸铅溶液+1 mL叶酸悬浊液灌胃)、叶酸组(F组,自由饮水+1 mL叶酸悬浊液灌胃)。叶酸悬浊液按照0.4 mg/kg BW的灌胃剂量配制,各组大鼠每天灌胃1次,连续灌胃14 d后取肺脏组织,用免疫荧光法测定Nrf2、HO-1、CHOP、GRP78这4种蛋白的表达水平。结果表明:与C组相比,L组、I组和F组的初体重、末体重、日增重、净增重、肺脏指数无显著变化(P>0.05);L组、I组和F组肺脏中CHOP和GRP78蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);L组和I组肺脏中HO-1蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),Nrf2蛋白表达水平无显著变化(P>0.05);F组肺脏中HO-1蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),Nrf2蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。与L组相比,I组和F组的初体重、末体重、日增重、净增重、肺脏指数差异不显著(P>0.05);I组、F组肺脏中HO-1和CHOP蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),Nrf2和GRP78蛋白的表达水平均无显著变化(P>0.05)。由以上结果可知:1)铅暴露使大鼠肺脏中HO-1、CHOP蛋白的表达水平升高,而叶酸干预后降低了HO-1、CHOP蛋白的表达水平;2)铅暴露引起的大鼠肺脏氧化应激、内质网应激分别与Nrf2/HO-1、GRP78/CHOP通路密切相关,叶酸对HO-1、CHOP蛋白的表达有直接影响;3)0.4 mg/kg BW的叶酸对0.2%醋酸铅暴露引起的氧化应激和内质网应激而造成的大鼠肺脏损伤具有一定的拮抗作用。

毛白杨雄花序水提取液对畜禽微生物的体外抑制试验

为了筛选出具有无毒、抗菌效果好的中兽药,试验通过微量抑菌法观察毛白杨雄花序水煎液对鸡大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌C79-1和兔大肠杆菌O123的体外抑制情况。结果表明:毛白杨雄花序水煎液对鸡大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌C79-1和兔大肠杆菌O123的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.125 0 g/mL、0.062 5 g/mL和0.062 5 g/mL。说明毛白杨雄花序水煎液对鸡大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌C79-1和兔大肠杆菌O123均具有体外抑制作用,可应用于临床治疗畜禽大肠杆菌病。