猪颗粒细胞中Ran的定位及作用

试验成功地培养了猪颗粒细胞,并采用激光共聚焦显微技术研究细胞有丝分裂过程中Ran的定位变化。结果表明,猪间期颗粒细胞中,Ran主要分布于细胞核内,核仁内没有Ran分布,细胞质中Ran浓度极低。核膜破裂,细胞进入有丝分裂,Ran分布到整个细胞,但在染色体周围浓集;在有丝分裂中期,浓集区形态和纺锤体的形态一致;在有丝分裂后期和末期,Ran的浓集区随纺锤体的拉长而分布于被分开的两组染色体之间;有丝分裂结束后,随着细胞核的形成,Ran在染色体周围浓集,核膜形成后又浓集于细胞核内,在整个有丝分裂中,Ran在细胞分裂区的细胞膜下未见特殊分布。这些分布与Ran在细胞周期中的作用是一致的。

过表达Gpr3诱导猪颗粒细胞G_1阻滞及凋亡

G蛋白偶联受体3(Gpr3)属于G蛋白偶联受体视紫质家族成员.Gpr3通过激活Gs蛋白介导的下游信号通路,维持卵泡卵母细胞减数分裂的前期阻滞,但在卵泡颗粒细胞中的作用不清.为了明确Gpr3在猪卵泡颗粒细胞中的功能,构建了Gpr3基因的真核表达载体,利用过表达的方式激活其介导的信号通路,并利用MTT、流式细胞术和real-time PCR等方法检测了过表达Gpr3对猪卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响.结果显示,过表达Gpr3后,猪颗粒细胞的增殖水平显著下调,G0/G1期细胞的百分比增加,S期细胞减少,Cyclin B1和CDK1 mRNA的表达量也显著降低;同时,显著增加了颗粒细胞的凋亡率,在抑制Bcl-2表达的同时,促进了Bax的表达.结果表明:过表达Gpr3在猪颗粒细胞中具有抑增殖促凋亡的作用,丰富了其在调节卵泡发育过程中的生物学功能.

猪卵泡闭锁过程中circINHBB的鉴定及其对颗粒细胞凋亡的影响

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA(circRNA)是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs(ncRNAs)。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素(INH)是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA(si-circINHBB),在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。

母猪卵巢颗粒细胞的分离培养及鉴定

颗粒细胞是卵巢卵泡重要的结构组分,其形态、功能伴随原始卵泡的生长启动、增殖、分化、闭锁、排卵以及黄体形成等生理过程发生各种变化。颗粒细胞是研究细胞增殖、分化和细胞相互作用、信号转导通路的理想细胞模型。利用注射器吸取有腔卵泡卵泡液,成功分离培养了猪有腔卵泡的颗粒细胞,并进行了FSHR免疫荧光检测以及原代猪卵巢颗粒细胞生长活力检测,结果表明:该细胞对FSHR的免疫荧光呈阳性。流式细胞仪检测发现该细胞的细胞周期为24 h,但在培养4 d时细胞的活力最强。该研究结果为进一步研究母猪卵巢卵泡功能奠定了基础。

FSH对体外培养猪卵巢颗粒细胞生长及增殖的影响

采集成年健康母猪的卵巢,收集卵泡颗粒细胞,在配制好的培养液中培养。颗粒细胞原代培养体系建立成功后,分别将不同质量浓度的FSH(0.1,0.5,1,5,25 ng/mL)作用于细胞,每隔48 h换1次培养液,加入新的FSH,倒置显微镜下检测细胞的生长及增殖状况。结果表明,FSH质量浓度越大,细胞生长状况越好,差异有统计学意义(P<0.05);在固定质量浓度的FSH作用下,细胞每次换液后生长状况都会变好。FSH能促进猪卵泡颗粒细胞增殖,并与作用时间长短有关。

重组质粒pGMLV-SC1 RNAi的构建及其对猪卵巢颗粒细胞c-Fos的影响

目的构建慢病毒载体及观察其介导的RNA干扰猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因表达情况。方法通过在线软件设计猪c-Fos基因shRNA序列,合成、退火形成双寡链核酸后克隆到PGMLV-SC1载体,测序。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞,包装成4组病毒(shRNA c-Fos1、shRNA c-Fos2、shRNA c-Fos3、shRNA c-Fos4),并测定滴度。感染猪卵巢颗粒细胞,采用PCR和Western blot检测各组细胞c-Fos mRNA和蛋白表达。结果重组克隆中插入片段序列与设计的Oligo序列完全一致。滴度为1×108TU/mL,感染复数30时,阴性对照组、实验shRNA c-Fos4、shRNA c-Fos3、shRNA c-Fos2、shRNA c-Fos1组c-Fos mRNA的表达分别为对照组的0.842 7±0.065 6、0.797 6±0.073 8、0.694 1±0.048 9、0.653 7±0.047 0、0.312 3±0.010 6倍(P<0.05),c-Fos蛋白的表达下降。结论实验shRNA c-Fos1组c-Fos基因下调最明显,成功构建猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因慢病毒RNAi表达载体并筛选出最佳siRNA序列。为c-Fos基因的功能研究提供了研究基础。

过氧化氢诱导猪卵巢颗粒细胞自噬及其对凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·L^(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响;Western-blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3,包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/SQSTM1的表达量变化,转染GFP-LC3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)提前4 h抑制自噬后再氧化应激12 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,CCK8检测细胞活力。[结果]氧化应激12 h后,细胞活力随过氧化氢浓度提高显著降低,凋亡率显著上升。在氧化应激前6 h LC3-Ⅱ相对表达量先增加后减少,P62的相对表达量先减少再增加;转染GFP-LC3质粒后,自噬体数量极显著上调,6 h后显著下降,上述结果表明在氧化应激早期自噬增加,持续氧化应激自噬受到抑制。若提前4 h用3-MA抑制自噬,再用过氧化氢处理12 h,抑制自噬后细胞凋亡率较单独氧化应激组显著下降,细胞活力也显著上升。[结论]氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡和早期自噬,若抑制早期自噬,凋亡率会下降。

褪黑素抑制玉米赤霉烯酮诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡

以原代培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,探究玉米赤霉烯酮(ZEA)对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响,并检测褪黑素(MT)在调节ZEA对猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用。结果表明,3和10μmol/L的ZEA对猪卵巢颗粒凋亡的影响不显著,但30、50和100μmol/L的ZEA显著促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡,且呈现剂量效应关系;0.1和1μmol/L的MT抑制30μmol/L的ZEA诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡,能够提高细胞活力。

氯化钴通过诱发DNA氧化损伤抑制猪卵泡颗粒细胞增殖的研究

旨在探究氯化钴(CoCl_(2))诱导的DNA氧化损伤对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响。本研究选取猪卵泡颗粒细胞作为试验材料,使用化学性低氧模型诱导剂CoCl_(2)处理猪卵泡颗粒细胞建立缺氧模型。前期研究已确定CoCl_(2)最适处理浓度,用200μmol·L^(-1) CoCl_(2)处理猪卵泡颗粒细胞12 h,将培养出的传代细胞分成4组处理,分别为:对照组、CoCl_(2)诱导缺氧处理组、GSH处理组、GSH+CoCl_(2)联合处理组。对照组为完全培养基培养12 h,CoCl_(2)诱导缺氧处理组给予终浓度200μmol·L^(-1) CoCl_(2)的培养基培养12 h,单独GSH处理组加入浓度为2 mmol·L^(-1)的GSH处理12 h,GSH+CoCl_(2)联合处理组加入200μmol·L^(-1) CoCl_(2)和2 mmol·L^(-1)的GSH联合处理细胞后培养12 h。12 h后检测各组细胞增殖活性、ROS水平、γH2AX蛋白活性水平和Oxo-8-G水平。采用CCK-8法检测其增殖活性;采用双氯荧光素(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测ROS水平;Western blot检测γH2AX蛋白活性水平,采用FITC荧光小鼠单克隆抗体检测Oxo-8-G水平。为了进一步明确CoCl_(2)诱导的颗粒细胞增殖阻滞与DNA氧化损伤的关系,本试验在CoCl_(2)处理的基础上添加抗氧化物GSH处理12 h后检测细胞增殖、ROS水平、DNA氧化损伤等相关指标。与对照组相比,200μmol·L^(-1) CoCl_(2)处理猪卵泡颗粒细胞后,细胞增殖活力极显著降低(P<0.0001),缺氧组ROS水平极显著升高(P<0.0001),γH2AX蛋白表达极显著升高(P<0.0001),Oxo-8-G水平极显著升高(P<0.0001)。与缺氧组相比,在CoCl_(2)处理基础上添加GSH后,ROS、Oxo-8-G、γH2AX水平极显著降低(P<0.0001),并伴随细胞增殖活性的显著恢复(P<0.0001)。CoCl_(2)可抑制猪卵泡颗粒细胞增殖活性,机制与诱导DNA氧化应激损伤有关。

玉米赤霉烯酮对猪卵巢颗粒细胞毒性的研究

以体外培养的猪卵巢颗粒细胞为模板,研究了玉米赤霉烯酮(ZEA)对该细胞的毒性作用。结果表明,在所测浓度范围内,ZEA对卵巢颗粒细胞活性具有明显的抑制作用,且抑制作用随着浓度的增强而加大,并呈现剂量效应关系;60、90和120μmol/L的ZEA使细胞中的MDA含量均升高,呈现剂量效应关系;ZEA作用后,细胞中GSH-Px酶活力下降;TUNE检测发现凋亡细胞呈棕褐色,凋亡细胞间间隙明显加大,随着ZEA剂量的加大,棕褐色细胞逐渐增多,尤其是高剂量ZEA组,细胞核大部分被染成棕褐色,细胞皱缩,胞间几乎无连接;当Annexin标记FIFC、流式细胞仪检测发现,高剂量组(120μmol/L)ZEA处理后其凋亡率可达60.83%,坏死率很低,显示ZEA抑制猪卵巢颗粒细胞增殖主要是通过细胞凋亡,并非坏死途径。

MAPK信号通路介导养精种玉汤有效部位调节猪卵巢颗粒细胞雄激素水平的作用机制

目的通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路探讨养精种玉汤正丁醇(ZDC)及乙酸乙酯(YSYZ)提取物降低猪卵巢颗粒细胞雄激素水平的作用机制。方法分离并培养猪卵巢颗粒细胞,将细胞按不同浓度的MAPK抑制剂PD98059孵育,分为0(空白对照)、1、3、10、25μmol/L共5组,培养24 h后,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测17α-羟化酶/C17,20-裂解酶(cytochrome P450c17a,CYP17)mRNA表达水平,应用放射免疫测定法(RIA)检测细胞上清液雄激素(睾酮)含量,筛选最佳的PD98059作用浓度;采用10μmol/L PD98059干预卵巢颗粒细胞24 h后,将细胞培养液更换成含或不含有不同浓度(0、1、5、25、50 mg/m L)的养精种玉汤有效成分提取物ZDC及YSYZ干预不同的时间(3、6、18、24 h)后,采用Western blot法检测各组磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)、c-Fos及CYP17蛋白表达水平,RIA法检测细胞上清液睾酮含量。结果 10μmol/L PD98059可明显降低猪卵巢颗粒细胞p-ERK1/2蛋白表达,增加CYP17 mRNA表达,并可增加细胞上清液睾酮含量(P<0.05)。当养精种玉汤ZDC、YSYZ提取物浓度为25 ng/m L、作用时间为6 h时,可增加猪卵巢颗粒细胞p-ERK1/2、c-Fos蛋白水平并降低CYP17蛋白的表达,降低细胞上清液睾酮含量(P<0.05)。结论养精种玉汤有效成分通过增加MAPK的活性从而降低猪卵巢颗粒细胞的雄激素生成。

RNAi抑制Smad4基因表达对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响

Smad蛋白家族是TGF-β/Smad信号通路中的重要成员,其中Smad4在该信号转导途径中起着关键作用。本研究利用RNAi技术沉默Smad4基因,探讨其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响。设计并合成靶向Smad4的小分子干扰RNA,在脂质体的介导下转染猪卵巢颗粒细胞,荧光定量PCR检测Smad4 mRNA的表达情况;MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测细胞活性;TUNEL(原位末端核苷酸标记法)及Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax的mRNA表达水平。研究显示,Smad4-siRNA能有效抑制Smad4的mRNA表达(P<0.01),细胞活性由0.31减少到0.27,凋亡率由17.0%增加到22.1%,Bcl-2的mRNA表达显著下调。结果说明沉默Smad4基因可以促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡,其机制可能与调控Bcl-2表达有关。

miR-15a对猪卵泡颗粒细胞BDNF基因表达的影响

为探索miR-15a对猪卵泡发育的影响,选取健康大卵泡、中等卵泡和闭锁卵泡,研究不同卵泡中miR-15a的相对表达量以及其是否对卵巢颗粒细胞中有BDNF表达具有调节作用。分别抽取直径3-5 mm、大于5 mm健康卵泡和3-5 mm闭锁猪卵泡,采用q PCR检测发现闭锁卵泡中miR-15a表达显著升高。免疫组化结果显示中等健康卵泡颗粒细胞上BDNF、Tr KB均有表达,而在靠近卵泡腔的凋亡颗粒细胞BDNF免疫阳性反应较弱。分离培养猪卵巢颗粒细胞,过表达miR-15a能显著上调BDNF基因表达水平,Bcl-2基因表达有下降趋势但差异不显著;抑制miR-15a表达能显著抑制BDNF、bcl-2基因表达水平。Western-Blot结果发现,过表达miR-15a显著下调BDNF蛋白水平,而抑制miR-15a表达则能显著上调BDNF蛋白水平。实验结果显示miR-15a可能经由其靶基因BDNF参与猪卵泡的发育和闭锁。