猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

基于“猪鼻式防压贴”的预见性综合护理在行无创呼吸机辅助通气新生儿中的应用

目的 探讨对行无创呼吸机辅助通气的新生儿应用基于“猪鼻式防压贴”的预见性综合护理的干预效果。方法 选取2021年1月2日至2022年12月1日于扬州市妇幼保健院新生儿科接受无创呼吸机辅助通气的90例新生儿作为研究对象,并按1∶1比例随机分入对照组和观察组。对照组45例新生儿施以预见性综合护理,观察组45例新生儿施以基于“猪鼻式防压贴”的预见性综合护理,比较2组的护理效果。结果 护理1周及2周后,观察组的动脉血氧分压和血氧饱和度均高于同期对照组,动脉血二氧化碳分压均低于同期对照组(P均<0.05)。观察组的呼吸机通气时间和住院时间均短于对照组,肺表面活性物质使用次数少于对照组,氧合指数高于对照组(P均<0.05)。2组间并发症及鼻损伤发生情况相比,观察组的总发生率均低于对照组(P均<0.05)。结论 基于“猪鼻式防压贴”的预见性综合护理既可有效改善行无创呼吸机辅助通气新生儿的血气分析指标和临床相关指标,也可减少并发症及鼻损伤情况的发生。

液体培养法与qPCR法对检测猪鼻支原体灵敏度比较

为了比较《中国药典》已收录但相当耗时的液体培养法和未收录但相对快速的荧光定量PCR(qPCR)法对支原体检测的灵敏度,试验分别在猪鼻支原体生长的对数期(48 h)、稳定期(96 h)和衰亡期(144 h)取样,将样品10倍系列稀释后,使用液体培养法和qPCR法对各个稀释度进行检测(两种方法的样品加入体积分别为0.5 mL和5μL),以比较二者的灵敏度。结果显示:在存活支原体占比高的对数期和稳定期,液体培养法比qPCR法的检测灵敏度高约100倍;而在死亡支原体占比大幅增加的衰亡期,结果则相反,qPCR法反而比液体培养法的检测灵敏度高约1 000倍。当把对数期样品高速离心浓缩约100倍后再用qPCR法检测,其检测灵敏度比浓缩之前提高了约100倍。上述结果表明:影响液体培养法和qPCR法相对灵敏度的主要因素是各自体系中不同的样品加入体积和样品中存活支原体的比例,而由于前一因素导致的两种方法灵敏度的差异,可以通过高速离心浓缩的方法缩小,使两种方法的相对灵敏度基本相同。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立

建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。

胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定

目的 获得胃癌组织中存在猪鼻支原体感染的直接证据。方法 收集新鲜的胃癌手术标本 2 0例 ,利用PPLO培养基从胃癌组织中分离培养猪鼻支原体 ,并用聚合酶链反应 (PCR)检测阳性培养产物中猪鼻支原体的特异性基因序列片段。结果 除 1例标本细菌污染外 ,1 9例胃癌组织中有 4例获得阳性培养产物 ,阳性率为 2 1 1 % ;该 4例阳性培养物中均扩增出猪鼻支原体的特异性序列片段。结论 胃癌组织中存在猪鼻支原体感染 ,说明猪鼻支原体对人亦具感染性。

猪肺炎支原体与猪鼻支原体分离鉴定及鉴别检测

为建立猪肺炎支原体与猪鼻支原体的鉴别诊断方法,对从河南省及周边地区猪场采集的患呼吸道疾病的猪只样品进行支原体的分离培养,针对猪肺炎支原体与猪鼻支原体设计了2对引物,扩增片段大小分别为480 bp和360 bp,对所分离纯化的病原微生物进行了菌落形态观察及分子鉴定。结果显示,分离的病原微生物为支原体,菌落呈典型的"煎蛋样"特征;通过单一PCR扩增反应,分别得到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体相应的目的扩增片段。表明分离到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体。在单一扩增的基础上,建立了猪肺炎支原体与猪鼻支原体二重PCR反应方法,可同时得到2条目的条带,与单一PCR扩增结果一致。表明建立的二重PCR方法可用于猪肺炎支原体与猪鼻支原体的同时检测和鉴别诊断。

猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能研究

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症,感染率极高,且与人类肿瘤的发生有关,对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白(vlp)家族参与支原体黏附宿主细胞的过程,本试验主要详细研究vlp家族成员之一vlpA的黏附细胞功能,特别是其Ⅲ区重复片段重复次数变化对其黏附能力的影响。根据GenBank中已公布的vlpA的基因序列,设计引物,从菌体DNA中扩增获得vlpA基因,或者人工合成Ⅲ区重复片段重复次数不等的一系列vlpA基因,均克隆至pET-32a(+)质粒中进行表达,获得目的蛋白质。同时利用固相合成法制备含两段Ⅲ区重复片段的多肽。利用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验检测所制备的各种重组vlpA蛋白和多肽的黏附功能。通过诱导表达和镍柱亲和层析纯化,成功获得纯度较高的各个目的蛋白质。利用间接免疫荧光试验证实vlpA可以黏附宿主细胞;利用微孔板黏附试验定量检测不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白及Ⅲ区重复片段多肽的黏附能力,结果发现vlpA0可黏附细胞,而Ⅲ区重复片段多肽无明显黏附能力;进一步利用微孔板黏附试验检测含Ⅲ区重复片段次数分别为3、6、9、12次的重组蛋白vlpA3、vlpA6、vlpA9、vlpA12的黏附能力,结果显示四种重组蛋白质均可黏附细胞,但黏附水平均低于不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白,且随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加黏附能力下降。本研究结果提示vlpA为猪鼻支原体黏附因子之一,其Ⅱ区含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加明显减弱。本研究结果有助于进一步研究猪鼻支原体的黏附及致病机制。

猪鼻黏膜作为鼻腔给药离体实验用黏膜的可行性实验研究

目的:以水蛭素为模型药物,考察猪鼻黏膜作为鼻腔给药离体实验用黏膜的可行性。方法:以同位素示踪法标记和测定水蛭素,采用Valia-Chien水平扩散池法,以兔鼻黏膜作对照,计算猪鼻黏膜和兔鼻黏膜的累积渗透量和渗透系数。结果:离体猪鼻黏膜与离体兔鼻黏膜比较,渗透系数无显著性差异(P<0.05)。结论:猪鼻黏膜可以作为鼻腔给药离体实验用黏膜。

猪鼻支原体TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为建立快速检测猪鼻支原体(M.hyorhinis)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对M.hyorhinis的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3%(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于M.hyorhinis临床样品的检测,对M.hyorhinis的快速和定量检测具有重要意义。

猪鼻支原体抗原在人结肠腺癌细胞表达的研究

目的 :通过研究猪鼻支原体 (Mhy)相关抗原在人肿瘤细胞的表达情况 ,以初步探讨Mhy与肿瘤的关系。方法 :通过培养Mhy提取其抗原 ,免疫家兔后获得其特异性抗血清 ,然后使用链霉亲和素 生物素过氧化物酶(SABC)方法 ,检测 32例人结肠腺癌和 5例胚胎不同组织细胞标本。结果 :Mhy相关抗原在 2 9例癌细胞胞膜及胞浆中有表达 ,在癌周正常组织细胞和胚胎细胞无表达 ,阳性率 90 .6 %。结论 :人某些恶性肿瘤细胞胞浆及胞膜存在Mhy相关抗原 ,作为一种新的肿瘤标志物用于恶性肿瘤的检测以及在研究支原体与人恶性肿瘤的关系方面具有一定的理论和实际意义。

猪鼻支原体3种核酸检测方法的临床应用比较

为研究猪鼻支原体(Mhr)核酸检测方法的优越性及在临床应用中的价值,本实验比较了常规PCR、套式PCR和荧光定量PCR 3种方法的敏感性,并进行了临床样品的检测。常规PCR敏感性为104拷贝/μL,套式PCR和荧光定量PCR敏感性均为10拷贝/μL;对74份肺组织、36份气溶胶、99份鼻拭子和47份气管支气管灌洗液样品进行检测,常规PCR、套式PCR、荧光定量PCR检出率分别为18.0%(46/256)、53.9%(138/256)和55.1%(141/256)。常规PCR与套式PCR、荧光定量PCR方法的检出率差异极显著(p<0.01),而套式PCR与荧光定量PCR方法的检出率差异无显著性(p>0.05)。结果表明,套式PCR敏感性高,具有较高的临床实用价值;荧光定量PCR敏感性高,最具有实验室诊断价值,但对操作者要求较高;常规PCR方法敏感性稍低,可能造成漏检,但易于操作,对条件简单的基层实验室仍有一定的实用性。在检测临床样品时,推荐采用套式PCR结合荧光定量PCR,结果更为准确可靠,可以提高Mhr的检出率。

猪鼻支原体与猪地方性肺炎

猪鼻支原体(Mhr)是小猪呼吸道的常在菌,在猪群中的检出率很高,可引起猪发生肺炎、多浆膜炎、关节炎和中耳炎,一定程度上影响了猪的生长和生产性能,并可继发其它病原感染,加重呼吸道症状。Mhr也是细胞培养的常见污染物和多种癌症的诱发因素。Mhr引起猪肺炎的机理除了在病理变化方面有介绍外,其深层次的机制还未见报道,其在呼吸道移行及诱导全身性疾病的机制也不清楚。本文将从猪地方性肺炎(SEP)及主要致病原、可能的致病机理和研究方法方面进行阐述Mhr肺炎,为该病的研究和防治提供新思路与新手段,同时也为Mhr和其它病原共感染的研究提供借鉴。

猪鼻支原体表面可变脂蛋白VlpB黏附宿主细胞功能研究

猪鼻支原体表面可变脂蛋白(Vlp)家族在黏附宿主细胞中起重要作用。为研究Vlp家族成员VlpB的黏附细胞功能,包括不同区段的黏附能力,以及其Ⅲ区重复片段的重复次数对黏附能力的影响。本研究利用间接免疫荧光和微孔板黏附试验验证了VlpB的黏附细胞能力。然后根据GenBank中登录的vlpB基因序列,构建了仅含Ⅱ区基因的重组质粒pET-32a(+)/vlpBn,诱导表达后纯化,获得纯度较高的重组蛋白Vlp B0;同时化学合成Ⅲ区重复片段PepVlpB并与KLH偶联;进一步合成Ⅲ区重复次数分别为3、6、9、12的一系列vlpB基因,构建pET-VlpB,诱导表达获得相应的重组蛋白VlpB3、VlpB6、VlpB9和VlpB12。利用微孔板黏附试验定量检测上述重组蛋白和偶联蛋白的细胞黏附能力。结果显示,仅含Ⅱ区的重组蛋白Vlp B0及含Ⅲ区重复片段的偶联蛋白KLH-PepVlpB可黏附宿主细胞;比较不同Ⅲ区重复次数的VlpB蛋白的黏附水平,结果显示,随着Ⅲ区重复次数增多,VlpB黏附能力逐渐下降。本研究证实Vlp B作为猪鼻支原体的黏附因子之一,其Ⅱ区和Ⅲ区均含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随Ⅲ区重复次数增加而降低。本研究结果为猪鼻支原体黏附及致病机制研究提供启示。

猪鼻支原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立

猪鼻支原体是猪体内的一种常在菌,可引发猪的多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、心包炎等炎症。由于猪鼻支原体与猪其他支原体有较高的交叉反应,目前并没有特异性的血清学诊断方法的报道。本试验以建立猪鼻支原体特异性ELISA检测方法为目的,将猪鼻支原体的表面可变脂蛋白Vlp的特定肽段作为包被抗原,优化该方法检测条件,最终确定:其抗原的最佳包被浓度为0.312 5μg·mL^(-1);一抗的最佳稀释度为1∶100,作用时间为30min;二抗的最佳稀释浓度为1∶20 000,最佳作用时间为30min;显色时间为10min;阴阳性的判定值为0.27。交叉性试验结果显示,Vlp抗原与猪其他支原体阳性血清及猪常见传染病阳性血清均无交叉反应。在重现性试验中,批内及批间的变异系数均低于10%,证明重现性良好。利用所建立的方法对已知阴性及阳性样本进行检测,结果显示特异性和灵敏度均良好。最后,用建立的方法对人工感染后28d的猪血清和247份临床样品进行检测,感染猪血清抗体呈阳性,建立的Vlp-ELISA方法、吐温20膜蛋白-ELISA方法对不同猪群临床样品检测的阳性率趋势相同。综上所述,建立的Vlp-ELISA方法特异性、稳定性良好,可以广泛用于临床猪鼻支原体血清抗体检测,为该病的检测和防控提供了重要工具。

用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体污染已被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受支原体污染的细胞提供了参考。

猪鼻支原体可变脂蛋白家族重组蛋白的构建表达及黏附细胞功能检测

目的本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp)家族为研究对象,鉴定其各成员对宿主细胞的黏附能力。方法根据已公布的猪鼻支原体vlp家族7种成员的基因序列设计引物,构建重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,筛选获得阳性克隆。重组工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白,经镍柱亲和层析获得7种纯化的vlp重组蛋白。利用间接免疫荧光法及微孔板定量法分别对vlp各个成员的黏附功能进行鉴定。结果成功构建了7种重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,获得阳性重组工程菌。经IPTG诱导及镍柱亲和层析纯化,获得了较纯的7种vlp重组蛋白。间接免疫荧光及微孔板黏附定量试验检测结果显示,重组蛋白vlpA、vlpB、vlpC、vlpE、vlpG可黏附PK细胞,而重组vlpD和vlpF蛋白黏附能力不明显。结论本研究成功构建了猪鼻支原体7种vlp的重组蛋白,并对其黏附功能进行了初步鉴定,证明部分vlp属于猪鼻支原体的黏附因子。

抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立

目的制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测。方法用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Western blotting确定IgG亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性。结果共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为IgG1、IgG2aI、gG2bI、gG3,免疫印迹结果表明单抗ZB1、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZB10与相对分子质量为70×103的抗原有特异性结合。确定了2个配对抗体(ZB1-ZB1-HRP和ZB1-ZB2-HRP),可检出最小抗原量为30 ng/mL,检出猪鼻支原体活菌8.34×102CFU/mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测。

猪鼻支原体套式PCR诊断方法的建立及应用

为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10^(-5)ng/μL,与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测,阳性检出率为73.9%。本研究建立的猪鼻支原体套式PCR具有特异性强、敏感性高等优点,可用于猪鼻支原体的临床诊断。

猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立

目的猪鼻支原体是临床猪场的常见病菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤有明显相关性,但其致病机理有待深入,其感染细胞机制的研究尚未明确,因此,本研究欲建立一种用间接免疫荧光技术检测猪鼻支原体黏附宿主细胞的方法。方法以猪鼻支原体和猪肾上皮细胞为研究对象,以兔抗猪鼻支原体纯化抗体为一抗,以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立猪鼻支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法(IFA)。结果最终确定最小黏附滴度为1∶107 CCU/mL,猪鼻支原体黏附PK15所需时间为6h以上,一抗的最佳工作浓度为1∶100,二抗的最佳工作浓度为1∶1 600。结论表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪鼻支原体对宿主细胞的黏附作用。为猪鼻支原体的研究特别是感染细胞机制的体外研究提供基础方法,同时为疾病的诊断及疫苗的研发奠定基础。

猪鼻支原体攻毒模型研究进展

猪鼻支原体是第一种从猪体内分离到的病原体,可引起猪的肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎等临床症状,对养殖业造成巨大危害。同时证实其与多种人类肿瘤有明显的相关性,也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。目前对猪鼻支原体的预防较为困难,暂无理想的抗生素和疫苗。猪鼻支原体攻毒模型是进行致病机理、疫苗评价及药物等研究的基础。本文就目前猪鼻支原体常用攻毒模型的研究进展进行综述。