猪Akirin2基因的定位及其影响IL-1β和IL-6 mRNA表达的研究

本研究旨在研究猪新天然免疫相关基因Akirin2所表达的蛋白在细胞中的定位,以及在受到外源刺激物LPS刺激时,对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达的影响。本试验用实验室构建好的pEGFP-Akirin2真核表达载体转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用激光共聚焦显微镜分析Akirin2在SUVEC的定位,并用LPS作为外源刺激物刺激转染Akirin2基因的细胞,荧光实时定量分析细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量的变化。结果表明,Akirin2基因编码的蛋白严格定位于细胞核之内,并在核仁区有明显表达,在LPS刺激后,Akirin2基因对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量都具有明显上调作用。本研究证实了Akirin2蛋白的亚细胞定位及其对细胞因子表达的影响,为Akirin2基因的作用机制的进一步研究奠定了基础。

猪akirin2基因的克隆与真核表达

Trizol法从猪脾脏中提取总RNA,RT-PCR方法得到猪Akirin2的完整编码区,软件分析猪Akirin2的核酸序列与蛋白序列,进行染色体定位。将Akirin2构建到带有荧光标记的真核表达载体pEGFP-C1中,通过脂质体转染法将pEGFP-Akirin2转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC)中进行表达。结果表明,该序列编码203个氨基酸,猪akirin2基因定位于猪1号染色体,含有4个外显子,猪与牛的Akirin2蛋白高度同源。重组表达质粒pEGFP-Akirin2经双酶切鉴定和测序分析,表明构建成功,pEGFP-Akirin2转染SUVEC细胞后,经荧光检测证实转入的akirin2基因得到表达。研究结果为探讨猪Aki-rin2蛋白在免疫调控中的功能提供了基础数据。

猪akirin2基因的组织表达谱及序列分析

克隆猪的akirin2基因,并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp(Gen Bank登录号KC140110.1),推测的氨基酸序列包含203个氨基酸,为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析,用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示,猪akirin2基因在脑组织中高表达,在淋巴、睾丸中表达量相对较低,在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示,猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高,均为96%,与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现,存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28,推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上,几个不同物种的akirin2蛋白分成3支,结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近,与鸡的亲缘关系最远。

杜撒♂×大长撒♀杂种猪LTBP2基因多态性及其与生产性状的关联研究

本文旨在研究杜撒♂×大长撒♀杂种猪LTBP2基因多态性及其对育肥、胴体和肌肉品质的影响。测定了321头杜撒♂×大长撒♀杂种猪育肥、胴体和肌肉品质,采用PCR产物直接测序法检测LTBP2基因外显子区单核苷酸多态性,分析LTBP2基因多态位点与育肥、胴体、肉质的关联。共检测到T97770379C、C97752805T、C97752792A、A97751432C和C97750084T5个错义突变位点,除C97752792A位点为低度多态外,其余位点为中度多态;T97770379C位点CC型肋骨数多于TT和TC型(P<0.01);C97752805T位点CC型60~100kg日增重(P<0.01)、30~100kg日增重(P<0.05)大于TT型,活体背膘厚和肋骨数小于TT型(P<0.01),大理石纹评分大于CT型和TT型(P<0.05);C97752792A位点CC型30~60 kg日增重大于CA和AA型(P<0.05);A97751432C位点AA型30~100kg日增重(P<0.01)、60~100kg日增重和肋骨数(P<0.05)小于CC型,眼肌面积和瘦肉率大于CC型(P<0.01);C97750084T位点CC型失水率(P<0.05)、60~100kg日增重、30~100kg日增重和大理石纹评分(P<0.01)低于TT型,眼肌面积和瘦肉率高于TT型(P<0.01)。表明,LTBP2基因T97770379C、A97751432C和C97752805T可增加杜撒♂×大长撒♀杂种猪肋骨数,C97752805T可导致背膘变厚;C97752792A可导致前期生长变慢,C97752805T可导致后期生长变慢,C97750084T和A97751432C可导致后期生长加快;C97752805T可导致眼肌面积增大、瘦肉率增加、大理石纹评分降低,A97751432C和C97750084T可导致眼肌面积和瘦肉率降低;C97750084T可导致肌肉失水率和大理石纹评分增加。LTBP2基因T97770379C、C97752805T、C97752792A、A97751432C和C97750084T这5个位点可作为撒坝猪生产性状的候选分子标记。

密码子优化和信号肽对猪圆环病毒ORF2基因在毕赤酵母表达中的影响

为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-ORF2和p PICZα-C-ORF2op。将线性化的重组质粒电转化毕赤酵母GS115,并筛选Zeocin抗性重组子。同时,也研究了信号肽对PCV2ORF2表达效率的影响。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,只有经密码子优化且去除ORF2基因自身信号肽的重组子能够分泌表达PCV2 ORF2蛋白,目的蛋白分子质量约为30 ku,表达的重组ORF2蛋白可被PCV2阳性血清识别,具有生物学活性。

保山猪精子获能相关基因ABHD2的分子特征及转录调控研究

本文旨在研究保山猪2-酰基甘油脂肪酶(Abhydrolase Domain-Containing Protein 2,ABHD2)在精子获能过程中的转录调控特征及生物学功能。对12月龄保山猪的睾丸进行转录组测序;利用转录组测序数据构建ABHD2的ceRNA调控网络分析图;分析ABHD2的氨基酸序列在多个物种间的同源性和蛋白质功能特性,并构建多物种蛋白质进化树和互作网络。结果表明,ABHD2基因的CDS长度为1 278 bp,编码425个氨基酸,定位在7号染色体,含有11个外显子。疏水性分析结果发现ABHD2蛋白质N端和C端均亲水,其二级结构中α螺旋的占比最大,所占比例达到44.47%。系统进化分析表明ABHD2的氨基酸序列在多物种中相似度高达98%,较为保守。对ABHD2及其邻近基因分析发现其邻近基因在各物种中以高度保守的形式分布。蛋白互作网络分析结果中发现了多个与ABHD2互作的蛋白,互作强度从高到低依次为SPA17、ZPBP、PRKAR2A、CATSPER1、ABHD16A、ABHD4,这些蛋白主要参与精子获能、顶体反应、阳离子通道络合物、精子鞭毛、细胞识别、羧酸酯水解酶活性、钙调蛋白结合、钙活化阳离子通道活性等相关通路。ceRNA调控网络揭示ABHD2基因受ssc-miR-151-3p调控,ABHD2可与2个lncRNA竞争ssc-miR-151-3p。本研究从多个角度分析了ABHD2的分子特征和转录调控功能,为进一步研究ABHD2基因在保山猪睾丸精子获能中的作用奠定了基础。

大白猪RFRP基因外显子2多态性及其与母猪繁殖性状的关联

本研究旨在揭示大白猪RFRP基因外显子2多态性及其对母猪繁殖性状的影响。通过PCR产物直接测序法检测了403头大白母猪RFRP基因外显子2区域的SNP位点,结合403窝初产母猪繁殖性能记录,利用最小二乘模型分析了RFRP基因各SNP位点不同基因型及其单倍型组合与大白母猪6个繁殖性状的关联。结果显示:RFRP基因外显子2区域存在2个错义突变位点(C294T和C357T)和3个同义突变位点(G289A、G331A和T349G),且均处于Hardy-Weinberg平衡状态;在5个位点中,除G331A和T349G位点呈低度多态(PIC为0.1740)且遗传多样性较低(H为0.1926)外,G289A、C357T和C294T位点均呈中度多态(PIC在0.2911~0.3730之间),遗传多样性也较为丰富(H在0.3537~0.4960之间);关联分析结果表明,G289A、C294T和C357T位点突变杂合型(GA、CT和CT)个体以及G331A和T349G位点突变纯合型(AA和GG)个体的繁殖性能较好;5个位点不同单倍型组合对大白猪的妊娠期、产活仔数、初生窝重、21日龄窝重和断奶窝重均有影响(P<0.05或P<0.01),且携带有GCGTC单倍型个体的大部分繁殖性能处于较高水平。上述研究结果表明,RFRP基因多态性与大白初产母猪的妊娠期、产活仔数、初生窝重、21日龄窝重和断奶窝重显著相关,RFRP基因可作为大白猪分子育种的候选基因。

湖南一株猪非典型瘟病毒的鉴定及其NS5B和E2基因序列分析

随机挑选湖南某规模化猪场出现“抖抖病”的新生仔猪,采集血清样本,用可扩增猪非典型瘟病毒(APPV)的NS5B基因和E2基因引物进行RT-PCR鉴定,对PCR扩增产物测序。随后利用MegAlign软件分析NS5B和E2基因序列的同源性,预测E2蛋白部分结构,并使用MEGA 5.0,采用邻接法构建NS5B和E2基因的遗传进化树。结果表明,发病仔猪为猪非典型瘟病毒(APPV)感染阳性。鉴定毒株HN0626与GenBank中84株参考毒株NS5B和E2基因序列的同源性分别为81.68%~98.95%、81.14%~99.33%,通过预测E2蛋白部分结构,推导其潜在的B细胞抗原表位。系统发育分析显示,HN0626毒株属于基因1型,是全球猪群中的主要流行毒株,其E2、NS5B基因序列在GenBank中的登录号分别为OR936135、OR936136。

副猪嗜血杆菌OmpP2基因分子特征及重组乳酸菌的构建与鉴定

猪格拉瑟病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的主要细菌性传染病。构建安全、有效的新型疫苗是防控该病的研究热点。本研究对OmpP2基因编码的蛋白质进行生物信息学预测分析后,应用无缝克隆技术把PCR扩增获得的OmpP2基因连接到pNZ8148载体,构建出pNZ8148-OmpP2重组载体,转入乳酸乳球菌感受态细胞,获得pNZ8148-OmpP2重组乳酸乳球菌;再进行蛋白表达与鉴定。结果表明:生物信息学预测到OmpP2蛋白具备优势B细胞和T细胞表位,是具有潜力的候选抗原;经重组乳酸乳球菌蛋白表达与鉴定,检测到大小约为38.5kD的目的条带,与预期大小相符。说明乳酸乳球菌能作为递送载体成功表达G.parasuis异源蛋白。本实验为后续G.parasuis乳酸菌活载体疫苗的研制奠定了基础。

柯乐猪MMP2基因多态性及其与繁殖性状的关联分析

【目的】探究基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)及其与繁殖性状的相关性,筛选与柯乐猪繁殖性状相关的遗传标记。【方法】试验选择212头健康的经产柯乐母猪,采用直接测序法筛选柯乐猪MMP2基因SNP位点,利用RNAfold在线软件预测MMP2基因不同单倍型mRNA二级结构,并通过SPSS 22.0软件分析MMP2基因SNP位点与柯乐猪繁殖性状的相关性。【结果】在柯乐猪MMP2基因第2外显子中检测到1个SNP位点(g.30062403 C>T),在第4外显子中检测到2个SNPs位点(g.30065309 C>T和g.30065312 C>T),均存在3种基因型(CC、CT和CT)。遗传特性分析结果显示,g.30062403 C>T位点为低度多态,g.30065309 C>T和g.30065312 C>T位点属于中度多态。卡方适合性检验结果显示,g.30062403 C>T位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05),另2个位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。连锁不平衡分析结果显示,g.30065309 C>T和g.30065312 C>T位点之间存在强连锁不平衡。单倍型mRNA二级结构分析显示,单倍型H1的mRNA二级结构与原序列相同,其他3种单倍型均导致mRNA二级结构和最小自由能发生变化。关联分析结果显示,g.30062403 C>T位点TT基因型个体的窝产活仔数显著高于CC基因型,断奶窝重显著高于CT基因型(P<0.05);g.30065309 C>T位点CC基因型个体的断奶仔数显著高于TT基因型(P<0.05);g.30065312 C>T位点TT基因型个体的窝产活仔数、断奶仔数均显著高于CT基因型(P<0.05)。双倍型H2H2为窝产仔数、窝产活仔数、断奶仔数、断奶窝重的优势双倍型,H1H4为初生窝重的优势双倍型。【结论】柯乐猪MMP2基因3个SNPs位点与其窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重、断奶仔数及断奶窝重均存在显著关联性,可作为分子育种遗传标记。

宫内发育迟缓猪胎盘SLC7A2基因过表达对滋养层细胞增殖和迁移的影响

【目的】探究溶质载体家族7成员2基因(SCL7A2)在正常初生重(NBW)和宫内发育迟缓(IUGR)猪胎盘中的表达差异,明确SCL7A2基因过表达对猪滋养层细胞(pTr2)增殖和迁移的影响,为揭示猪IUGR的发生发展机制提供参考依据。【方法】采用实时荧光定量PCR检测NBW和IUGR胎盘中SLC7A2基因相对表达量,通过免疫组织化学试验分析NBW和IUGR胎盘组织中SLC7A2蛋白的定位分布及表达情况,利用CCK-8试验检测SLC7A2基因过表达对pTr2细胞增殖能力的影响,并以细胞划痕试验检测SLC7A2基因过表达对pTr2细胞迁移能力的影响。【结果】IUGR胎盘中的SLC7A2基因相对表达量极显著高于NBW胎盘(P<0.01,下同);SLC7A2蛋白在仔猪胎盘的滋养层细胞和血管内皮细胞中均有表达,且IUGR胎盘中的SLC7A2蛋白表达水平显著高于NBW胎盘(P<0.05,下同)。以构建的SLC7A2基因过表达载体(Vector-SLC7A2+)转染pTr2细胞,细胞中的SLC7A2基因相对表达量较pEGFP-C1阴性对照载体(Vector-NC)转染组极显著上调,但pEGFP-C1的相对表达量与Vector-NC转染组无显著差异(P>0.05)。以Vector-SLC7A2+和Vector-NC分别转染pTr2细胞后,Vector-SLC7A2+转染组的pTr2细胞增殖效果在转染后12、24、48和72 h显著或极显著低于Vector-NC转染组,pTr2细胞迁移率则表现为Vector-SLC7A2+转染组极显著低于Vector-NC转染组,表明SLC7A2基因过表达能有效抑制pTr2细胞的增殖和迁移能力。【结论】SLC7A2基因过表达会抑制猪胎盘滋养层细胞的增殖与迁移,影响胎盘的形态发育和母—胎间的营养转运效率,进而诱发猪IUGR的发生发展。

吕梁黑猪BACE2基因克隆及表达分析

为探讨吕梁黑猪BACE2基因特点和结构,本研究采用PCR技术对该基因进行克隆,并对所编码的蛋白质开展生物信息学分析,分析内容包括蛋白质的理化性质、信号肽、亲疏水性、跨膜结构、序列比对、二、三级结构预测、亚细胞定位预测,以及互作关系;通过实时荧光定量PCR(qPCR)技术,研究BACE2基因在吕梁黑猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和脂肪组织中的表达情况。生物信息学结果显示,该黑猪BACE2基因的编码序列大小(CDS)为1545 bp,包含514个氨基酸;BACE2蛋白是一种疏水性蛋白,无信号肽,具有明显的跨膜作用,是一种非分泌型的蛋白质;序列比对发现吕梁黑猪同山羊、牛亲缘关系较近,同家鼠亲缘关系较远;蛋白的二级结构由无规则卷曲(49.03%)、α-螺旋(18.48%)、延伸连(27.24%)和β-转角(5.25%)构成,主要分布于内质网(55.6%)。qPCR结果显示,其肾脏组织中BACE2基因的表达水平最高,肌肉组织中的表达量最低。研究结果揭示了BACE2蛋白拥有的多种独特属性及BACE2基因的分布特点,为该蛋白更深层次的科学探究提供参考。

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

河南省猪细小病毒2型流行特征和遗传进化分析

为了解河南省猪细小病毒2型(PPV2)的遗传进化和流行特征,本试验对2021—2022年河南省不同地区猪养殖场送检的759份临床样品进行PCR检测,选取4份不同地区的PPV2阳性样品,对其进行全基因组测序,并与35条国内外PPV2参考序列进行同源性分析、系统发育分析和重组分析。结果显示,送检临床样品PPV2检出率为15.81%(120/759),与猪细小病毒7型(PPV7)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的混合感染率依次为35.83%、25.00%和20.83%。鉴定的4株PPV2分别命名为PPV2XM-15/2021、PPV2ZMD-20/2021、PPV2ZK-9/2021和PPV2SQ-16/2021。4株PPV2鉴定株的全基因组核苷酸同源性为95.0%~99.7%,处在不同进化分支,亲缘性较远,与35株PPV2参考株的全基因组核苷酸同源性为93.9%~99.8%、NS基因核苷酸和氨基酸同源性均为92.6%~99.8%、Cap基因核苷酸和氨基酸同源性均为88.7%~100%。PPV2ZMD-20/2021株、PPV2ZK-9/2021株和PPV2SQ-16/2021株可能为重组毒株。结果表明,河南省猪场PPV2检出率较高,且与多种病原混合感染,其中与PPV7混合感染最常见;PPV2遗传进化差异较大,存在重组现象,且重组位置不唯一。

香猪ADCY2基因结构变异鉴定及其与生长性状的关联分析

为了探究香猪腺苷酸环化酶2(Adenylate Cyclase,ADCY2)基因结构变异与香猪生长性状的关系,本研究以233头断奶香猪为实验动物,定期测量体尺指标,采集耳组织提取基因组DNA,利用PCR技术分析香猪ADCY2基因结构变异的遗传多样性,并与香猪体尺指标进行相关性分析。结果显示,香猪ADCY2基因中存在1个长度为305 bp的结构变异位点(ADCY2-I2-SV305),该位点检出3种基因型:纯合缺失DD型、正常的II型和杂合的ID型,其中II基因型频率(67.09%)显著高于ID和DD基因型;I等位基因为优势等位基因。ADCY2-I2-SV305位点与香猪多个日龄的体宽、胸围和腹围显著相关,且II基因型的香猪个体各项体尺指标均显著高于ID和DD型个体,提示该结构变异的缺失型不利于香猪生长发育。对ADCY2-I2-SV305变异位点的功能元件分析发现,该位点中含有1个简单重复元件和1个SINE元件,以及5个miRNA结合位点,推测该位点的缺失突变将导致这些重复元件的丢失,不利于ADCY2基因的表达,进而影响香猪生长发育。综上,ADCY2基因的ADCY2-I2-SV305结构变异与香猪生长发育显著相关,可作为香猪良种选育的分子标记。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

2021年我国部分省份猪圆环病毒2型流行病学调查和基因分析

为了解2021年我国猪圆环病毒2型(PCV2)流行情况,本试验于7个地区16个省采集1685份组织样品,采用实时荧光定量PCR检测方法检测PCV2,对其中45份阳性样品进行全基因组序列扩增和遗传演化分析。结果显示,被检样品PCV2总阳性率为9.85%(166/1685),场总阳性率为32.71%(35/107);各地区样品阳性率介于4.29%~19.00%,东北地区样品阳性率最高;各地区场阳性率介于6.90%~60.00%,华中地区场阳性率最高。PCV2a、PCV2b和PCV2d亚型分离毒株占比分别为31.11%、4.44%和64.44%,其中PCV2d亚型为优势流行株,未发现PCV2e和PCV2c亚型。有24株PCV2分离毒株的Cap蛋白在C末端有1个赖氨酸(K)延伸,另有1株PCV2分离毒株的Cap蛋白在C末端有1个蛋氨酸(M)延伸。结果表明,2021年我国PCV2感染范围广,污染程度高,且正在不断发生遗传变异,需要持续跟踪监测PCV2的流行情况,以便及时制定有效的防控措施。

猪细小病毒6型ORF 2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF 2基因,并制备PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF 2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白大小约为40 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该蛋白可与PPV6阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性;Western blotting间接与ELISA结果显示,纯化后免疫兔血清与PPV6全病毒蛋白发生特异性反应,抗体效价为1∶25600;IFA鉴定结果表明,PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白兔源多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究成功原核截短表达了PPV6 ORF 2基因并制备了兔抗PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白多克隆抗体,为PPV6血清学检测方法的建立和PPV6 VP1蛋白的进一步研究提供了参考。

猪细小病毒潍坊株的分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了分析猪细小病毒(porcine parvovirus virus,PPV)VP2基因遗传情况,从山东省潍坊地区某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到一株病毒,将病料处理后接种PK-15细胞,观察细胞病变,采用血凝和血凝抑制检测、电镜观察及对病毒VP2基因进行PCR扩增并进行遗传进化分析。结果显示:病毒接种到PK-15细胞后产生明显的圆缩、拉网、灶性脱落等病变;分离毒可凝集豚鼠红细胞,能被已知PPV阳性血清中和;电镜观察病毒为近似圆形、无囊膜、大小不一的病毒粒子,直径约20 nm;对病毒的VP2基因用PCR方法扩增后测序并进行遗传进化分析,测序后确定分离株为PPV,将其命名为PPV SD-21。VP2基因进化树发现,PPV SD-21株与Kresse株和NADL-2株等分离株处于同一分支,遗传距离较近,属于PPV基因Ⅰ型,PPV SD-21株与GenBank中PPV基因Ⅰ型中的10株PPV参考毒株的同源性为97.5%~99.8%,其中与NADL-2株的同源性为99.8%。PPV SD-21株的VP2基因序列只是个别碱基发生变化,所编码氨基酸未发生变异。上述实验结果说明该分离病毒为猪细小病毒基因Ⅰ型弱毒株,该毒株的分离鉴定可为猪细小病毒的诊断和流行病学研究奠定基础。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。