PAMs免疫粘附受体CR 1-like对PRRSV感染的影响

[目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome virus,PRRSV)感染PAMs的影响,为阐述CR1⁃like在PRRSV免疫应答中的生物学功能提供理论数据。[方法]采取PRRSV减毒活疫苗免疫接种PRRSV抗体为阴性的长白仔猪20~28 d后,提取分离抗病毒血清并检测抗PRRSV血清中和效价;将抗PRRSV血清进行不同倍比稀释,制备各类PRRSV抗原抗体复合物并接种于PAMs上,建立抗体依赖性增强(Antibody⁃dependent enhancement,ADE)模型,qRT⁃PCR技术检测各时间点PRRSV N基因拷贝数变化;PRRSV感染PAMs 9 h后,将抗血清和猪新鲜血清共处理细胞,运用ELISA测定不同时间点细胞上清液中猪新鲜血清C3b、C4b、CH50总活性;将PAMs分为试验组(PRRSV感染PAMs 9 h后同时加入抗血清和猪新鲜血清)和6个对照组,采用qRT⁃PCR技术检测各组不同时间点胞内和上清中PRRSV N基因的拷贝数,确定猪新鲜血清对PRRSV感染PAMs的作用;采用免疫阻断技术将PAMs分为FcR McAb阻断组、CR1⁃like McAb阻断组、共阻断组及3个对照组,qRT⁃PCR技术检测PRRSV N基因拷贝数变化,确定免疫粘附受体CR1⁃like对PRRSV感染PAMs的影响。[结果]抗PRRSV血清在PAMs上的中和抗体效价为1∶5.37;qRT⁃PCR结果成功筛选出1:20稀释度的抗PRRSV血清对病毒的复制具有促进作用;ELISA检测猪新鲜血清C3b、C4b和CH50浓度随PRRSV感染时间延长呈降低趋势;qRT⁃PCR结果显示,猪新鲜血清可以与1∶20稀释度抗PRRSV血清协同促进PRRSV的复制;qRT⁃PCR、免疫阻断技术得出1∶20稀释度抗PRRSV血清、猪新鲜血清协同促进PRRSV感染增强不只依赖于FcR,还与CR1⁃like有关。[结论]体外条件下,PAMs表面的CR1⁃like是介导PRRSV感染PAMs过程中产生ADE效应的分子之一,可与FcR协同促进PRRSV感染PAMs。

猪红细胞CR1-like膜分布状态的初步研究

为进一步研究猪红细胞的天然免疫调控机制,本研究合成免疫抗原肽段,制备获得了猪CR1-like单克隆抗体,并应用CR1-like单克隆抗体通过荧光免疫细胞化学技术观察猪红细胞CR1-like的天然分布状态,运用流式细胞检测技术检测了膜流动性变化对猪红细胞CR1-like发挥免疫黏附功能的影响。结果显示,于荧光显微镜下观察,猪红细胞表面可见绿色荧光,且经膜固定处理的猪红细胞表面的绿色荧光分布呈片状,未经膜固定处理的猪红细胞表面的荧光点呈颗粒状分布,较膜固定组分布明显成簇化;流式细胞仪检测荧光强度发现,膜固定组、未固定组均明显高于空白对照组,差异极显著(P<0.01);同时未固定组平均荧光强度明显高于膜固定组,差异极显著(P<0.01)。证实天然状态下猪红细胞表面的CR1-like分布呈分散状态,发挥免疫功能时,CR1-like表现出多价高效的结合特性,其分布状态表现为颗粒样成簇分布。

酵母双杂交pGADT7-C3b重组质粒的构建与鉴定

为了研究猪红细胞CR1-like与补体片段C3b的互作关系,试验构建符合酵母双杂交系统要求的重组质粒pGADT7-C3b,对合成的含C3b基因片段的质粒进行双酶切鉴定,运用基因重组技术将鉴定正确的C3b基因与表达载体pGADT7连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中筛选阳性克隆,将双酶切鉴定正确的重组质粒pGADT7-C3b转化至感受态酵母菌Y2HGold中并进行毒性检测和自激活检测。结果表明:合成的含C3b基因片段的质粒经双酶切鉴定得到的目的基因条带大小为1914 bp,将C3b基因与表达载体pGADT7连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,然后在含Amp的LB固体培养基中长出阳性菌落,重组质粒pGADT7-C3b经双酶切鉴定得到与预期大小相符的条带,经毒性检测发现转化有重组质粒pGADT7-C3b的Y2HGold酵母菌在SD/-Leu固体培养基上正常生长,在SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal固体培养基上长出白色菌落,在SD/-Leu/X-a-Gal/Aba固体培养基上无菌落生长。说明试验成功构建了pGADT7-C3b重组质粒,对Y2HGold酵母菌无毒性和自激活作用,符合酵母双杂交系统要求。