猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

为了克隆表达猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域(IFN2EC)基因,试验采用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中扩增出猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的cDNA序列,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,并将阳性重组质粒转化BL21(DE3)菌株,IFN2EC重组蛋白得到高效表达.将融合蛋白IFNR2EC免疫BALB/C小鼠,获得鼠抗IFN2EC融合蛋白多克隆抗体,将得到的融合蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测.本研究成功构建重组表达质粒pET-IFNR2EC,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶12800,Western-blotting试验结果表明,制备的鼠抗IFNR2EC融合蛋白多克隆抗体可以与融合蛋白进行特异性结合,从而证明融合蛋白具有很好的免疫原性.

猪肾上皮细胞Ⅰ型干扰素受体1敲除对伪狂犬病毒复制的影响

目的探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。方法以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系。运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-time PCR等技术进行IFNAR1功能验证。结果随着PRV感染时间延长,敲除IFNAR1基因可以显著促进PRV-TK mRNA的转录,PRV-gE蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。结论IFNAR1在抑制PRV增殖中发挥重要作用。

猪肿瘤坏死因子受体相关因子6的克隆、表达及对伪狂犬病病毒的抑制效应

肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是天然免疫信号通路中重要的接头分子,笔者旨在探索猪TRAF6的抗病毒和免疫调控功能。首先利用RT-PCR从猪外周血单核细胞克隆该基因,并进行序列比对分析;其次利用Piggybac转座子系统建立猪TRAF6稳定表达的PK-15细胞系;最后在细胞水平检测猪TRAF6对伪狂犬病病毒复制的影响以及对猪IFN-β等启动子活性的影响。结果显示,猪TRAF6基因为1 623bp;将猪TRAF6基因连接到Piggybac转座子质粒成功构建真核表达载体PB-TRAF6,然后将重组质粒转染PK-15细胞,经药物处理和荧光筛选获得稳定表达TRAF6的细胞系;通过荧光定量PCR和Western blot确定稳定细胞系TRAF6的高效表达;体外抗病毒试验表明,TRAF6稳定细胞系能够显著抑制伪狂犬病病毒的复制;双荧光报告基因法检测发现,TRAF6可以促进poly(I:C)诱导的Ⅰ型干扰素应答。结果提示猪TRAF6具有显著的抗病毒和免疫调节功能,为研究TRAF6的免疫学功能奠定基础。