重组毕赤酵母产猪IFNα的诱导条件

采用Plackett-Burman实验设计,选取甲醇、酵母粉、蛋白胨、K2HPO4.12H2O、MgSO4、(NH4)2SO4、pH和PTM1这8个对重组猪IFNα表达量有影响的相关因子进行筛选,用SAS软件进行统计分析,分析表明:甲醇、蛋白胨以及K2HPO4.12H2O对重组猪IFNα表达量具有显著性影响;之后采用Box-Behnken设计及响应面分析法确定最佳的诱导条件。在最优条件下,重组猪IFNα表达量比优化前提高了2.46倍。

猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵

从发酵时间、接种量、pH值、诱导剂量等方面对重组基因工程(毕赤酵母甲醇利用缓慢型)的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IFNα的发酵工艺,包括种细胞密度对初始发酵期的影响,补加甘油、甲醇速率条件的控制等.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为96 h,甲醇最适浓度为8 g/L,发酵pH范围为6.4~9.0,最适接种量2∶1.在分批发酵、接种量为10%且种子细胞光密度(OD600)为5~6时,最有利于细胞的高密度培养,在补料发酵时,根据溶氧控制甘油流加速率与时机,细胞干重达到118.75 g/L,在48 h重组猪IFNα表达量达到1.304 g/L.

猪肺巨噬细胞源IFN-λ1的分子克隆、表达与活性分析

Ⅲ型干扰素（interferonlambda，IFN-λ）在机体抗病毒固有免疫、适应性免疫、黏膜免疫及抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。本研究利用RT—PCR技术从猪肺巨噬细胞CRL2845中扩增获得猪IFN—x1基因（pIFN—λ1），并进行遗传进化分析和信号肽预测；将含信号肽的pIFNX1基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3．1中，通过常规的质粒转化、阳性茵落筛选、质粒提取及酶切鉴定，获得重组质粒pcDNA-plFNλ1；利用脂质体转染CRL2845细胞，转染48h后通过qRTPCR、Westernblot、间接免疫荧光方法分析pIFNX1表达及胞内定位；收集转染细胞总RNA，通过qRT—PCR方法分析OAS1、ISG15、PKR、WITM3等干扰素刺激基因的表达，并利用舍报告基因的痘病毒VTT—EGFP感染瞬时表达pIFN—λ1的CRL2845细胞，通过流式细胞术分析pIFN—λ1抗痘病毒效果。结果显示，成功在猪肺巨噬细胞中扩增获得pIFN—λ1基因，并在CRL2845细胞内成功表达；瞬时表达后选择性诱导OAS1、ISG15的表达，并可抑制约38％的痘苗病毒感染CRL2845细胞。结果表明，瞬时表达pIFN—λ1能选择性诱导部分干扰素刺激基因的表达，且具有抗病毒活性，为深入研究猪IFN-λ1在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用奠定基础。

猪干扰素α基因的克隆与真核表达

目的克隆猪干扰素α(IFNα)基因,并在毕赤酵母中进行表达。方法用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中。筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础。

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达和下游工艺的研究

通过小量发酵、摇瓶发酵、大量发酵,研究猪α-IFN在毕赤酵母中表达的下游工艺,微量细胞板法测猪α-IFN体外抗VSV、PRRSV、TGEV的活性。猪α-IFN抗VSV的活性达到4.04×10^6I U/L,在PK15上抗TGEV的活性为10^7-10^8I U/L,在Marc 145上抗PRRSV的活性为10^6-10^7I U/L。30℃诱导培养96 h、甲醇添加1%、pH值6.0、DO20%、0.25%-0.4%甲醛灭活,获得高活性的、安全的IFN。仔猪免疫后临床症状正常,未出现病理学变化。猪α-IFN体外抗病毒活性高,发酵后的抗病毒活性未下降,免疫动物未产生临床症状和病理变化,可用于临床治疗病毒性疾病。