猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用 ,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导 ,提取总RNA ,然后采用RT PCR技术成功克隆了猪IFN γ基因。序列分析表明 ,克隆到的基因序列与NCBIGenBank上登载的猪IFN γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN γ的进一步研究和开发奠定了基础。

表达猪圆环病毒2型ORF2和猪IFN-γ基因重组腺病毒的免疫保护作用

本研究以构建的猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2和猪IFN-γ重组腺病毒(简称rAd-OI)为免疫原免疫30日龄、母源抗体为阴性的三元杂商品仔猪。25头猪随机分为5组,每组5头。A组肌注免疫rAd-OI 106.12TCID50/头,B组肌注免疫rAd-OI 107.12TCID50/头,C组肌注免疫rAd-OI 108.12TCID50/头,D组肌注免疫rAd-OI 109.12TCID50/头,E组不作免疫,留作攻毒对照。一免后21 d进行二免,二免后21 d进行第3次免疫,免疫后每周采血检测抗体水平。免疫后56 d(即第三次免疫后14 d)所有猪攻毒PCV-2,剂量为5×105.67TCID50/头。攻毒前后每周采血检测抗体水平及病毒血症情况。攻毒21 d后处死所有猪,检测组织中的病毒含量。结果显示C组的抗体水平一直显著高于其他各组,攻毒后的病毒血症也低于其他各组。结合抗体水平、免疫和攻毒后的临床症状以及病毒血症水平得出,C组的免疫剂量较为理想,此结果为PCV-2ORF2及猪IFN-γ重组腺病毒疫苗的生产开发提供了理论依据。

猪IFN-α_1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因。序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%。用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1。探讨了猪IFN-α1基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达。结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%。SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在。经预测,猪IFN-α蛋白为一结构松散的球状蛋白。

猪源IFN-λ3的克隆、表达及抗病毒活性分析

为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通过Western blot分析pIFN-λ3瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于PK15、MDCK细胞进行pIFN-λ3抗病毒活性分析。结果显示,本研究成功扩增获得pIFN-λ3基因,并在293细胞内成功表达;瞬时表达能够抑制表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSVG)在PK15、MDCK细胞上的增殖。本研究结果为深入研究猪源IFN-λ3在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用提供参考和依据。

锚定表达猪IFN-λ3重组植物乳杆菌的构建及其抗PEDV效果的检测

为构建锚定表达猪IFN-λ3的重组植物乳杆菌(L.plantarum),并验证其抗病毒活性,本研究将猪IFN-λ3基因插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭锚定表达载体pSIP-409-pgsA'中构建重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3,将其电转化至植物乳杆菌NC8中获得重组pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum。经清酒乳杆菌素(SPPIP)诱导后用His标签单克隆抗体经westernblot、间接免疫荧光检测目的蛋白的锚定表达情况。结果显示,猪IFN-λ3在重组植物乳杆菌表面锚定表达。利用重组菌刺激细胞后通过荧光定量PCR测定IPEC-J2/PEDV系统中猪流行性腹泻病毒(PEDV)载量,并检测该重组菌刺激细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的相对转录水平。结果显示,该重组菌能够显著抑制PEDV在IPEC-J2中的复制,并能诱导细胞中ISGs(OASL、IFITMs)的高转录水平,具有抗病毒作用。本研究为PEDV的预防和治疗提供可行方案。

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.

猪干扰素-γ基因在大肠杆菌中的克隆表达及其活性测定

目的在大肠杆菌中高效表达重组猪干扰素γ(porcineinterferongamma,poIFN-γ),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法选择大肠杆菌偏爱密码子人工合成了猪干扰素-γ成熟蛋白编码基因,克隆至原核表达载体pQE30中,IPTG诱导表达,表达产物经变性、复性、纯化后,测定其抗病毒活性。结果目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的84.5%,纯化后的纯度达到95%以上,在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6.2×105U/mg。结论PoIFN-γ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物具有抗病毒活性。

重组猪干扰素-α单克隆抗体的制备和鉴定

利用自动发酵罐培养毕赤酵母,甲醇诱导其分泌表达重组猪IFN-α（r Po IFN-α）;经硫酸铵沉淀、G-25琼脂糖柱脱盐处理及阴离子交换柱和分子筛层析纯化。以纯化r Po IFN-α蛋白作为抗原免疫6周龄BALB/c鼠3次后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选和3~5次亚克隆,共获得5株均能稳定分泌抗r Po IFN-α单克隆抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚类鉴定、特异性和叠加试验结果表明,这5株抗体均属于Ig G1亚类,能与r Po IFN-α产生特异性反应,其抗原结合位点相同或相近。该研究有助于进一步推动r Po IFN-α单克隆抗体在猪免疫学以及猪疫病诊断中的应用。

功能性猪α干扰素基因的表达及活性检测

[目的]检测克隆猪α干扰素基因(IFN-α基因)在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素(PHA)诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础。

口蹄疫病毒多基因及猪α干扰素共表达载体的构建及其免疫豚鼠效果研究

为探讨口蹄疫病毒多基因及猪α干扰素(IFN-α)基因共表达真核质粒进入临床试验的可行性,本试验用PCR方法扩增了口蹄疫病毒P12A3C及部分2B基因(P12X3C)和猪IFN-α基因,克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,经双酶切鉴定后,将重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α转染BHK-21细胞中,观察目的基因的表达,并将重组质粒免疫豚鼠,检测豚鼠的血清抗体水平、中和抗体滴度及T淋巴细胞增殖情况。结果显示,经酶切鉴定及DNA序列分析成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α,转染BHK-21细胞后,通过Western blotting、间接免疫荧光试验鉴定证实重组质粒能有效表达。ELISA结果显示,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α比重组质粒pBudCE4.1-P12X3C能诱导机体产生更高水平的抗口蹄疫病毒的血清抗体,且中和抗体滴度也高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组。MTT法检测结果表明,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组淋巴细胞增殖可达15%,而重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组则为11%。攻毒后重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组和灭活疫苗组保护率达100%,高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组的80%。本试验成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3CIFN-α,猪IFN-α作为佐剂可有效辅助口蹄疫DNA疫苗提高动物体内的免疫反应。

猪IFN-α14的表达、纯化及抗病毒活性分析

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽、优化密码子,并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因,将其克隆入pCSMH原核表达载体,优化诱导条件,利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析,获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白,Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后,接种1 000 TCID_(50)猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV),24 h收集细胞和上清,通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平,同时测定细胞上清中病毒的TCID_(50)。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化,证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比,猪IFN-α14抑制PEDV复制的活性显著提高,为新型抗病毒药物开发提供了重要的依据和数据支持。

重组猪IFN-λ3原核表达及其活性分析

应用RT-PCR技术从多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly(I∶C))刺激的ST细胞中扩增猪干扰素-λ3(PoIFN-λ3)基因。基因序列分析表明,PoIFN-λ3基因全长为588bp,与绵羊IFN-λ3基因(XM_004015683)的同源性最高(87.6%);分子遗传进化树分析表明猪IFN-λ3与牛、绵羊亲缘关系最近,与马、人、黑猩猩和鸡的亲缘关系次之。将PoIFN-λ3成熟肽序列定向插入pET-32a载体,转化宿主菌Rosetta gami B,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测分析表明,PoIFN-λ3基因获得表达,重组蛋白大小为32 000,以包涵体形式存在。重组蛋白经变性、纯化、复性后,用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性的测定。结果显示,复性后重组蛋白的含量约为1g/L,抗水泡性口炎病毒(VSV)活性达到2×103 U/mg,表明重组poIFN-λ3具有较高的抗病毒作用。

猪源IFN-λ3在CHO-S细胞中的表达及其抗口蹄疫病毒活性分析

为了探究猪源IFN-λ3蛋白能否在CHO-S悬浮细胞中表达以及表达蛋白的抗口蹄疫病毒(FMDV)活性,根据NCBI上的猪源IFN-λ3序列,构建真核表达载体pcDNA3.4-IFNλ3-His,将其转染至CHO-K1贴壁细胞中,用间接免疫荧光试验和Western-blot验证重组质粒是否表达IFN-λ3蛋白。将pcDNA3.4-IFNλ3-His转染至CHO-S悬浮细胞中大量制备IFN-λ3蛋白,用AKTA蛋白纯化系统纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定纯化出的蛋白,用细胞毒性试验分析纯化蛋白是否具有细胞毒性,用实时荧光定量PCR、Western-blot和空斑试验三种方法研究纯化蛋白的抗FMDV活性。结果显示,重组质粒pcDNA3.4-IFNλ3-His在CHO-K1细胞中瞬时表达IFN-λ3,在CHO-S细胞中以分泌形式表达IFN-λ3;用AKTA系统能够纯化出纯度较高的IFN-λ3蛋白;纯化出的IFN-λ3对PK-15细胞无明显毒性,能够抑制FMDV RNA的复制、减弱病毒蛋白翻译活动以及降低子代病毒的生成。本研究为发展新型FMDV防控策略提供了新方向。

猪IFN-α1重组蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其生物学特性

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经ELISA检测,体外细胞培养上清的效价均可达到1∶104,体内腹水的效价均可达1∶105;SDS-PAGE分析显示,纯化的这3株单克隆抗体的重链分子质量均在60ku以上,轻链均在30ku以上,符合抗体IgG重链、轻链分子的大小;抗体亚类鉴定表明4E9、5B2为IgG2a类,5H11株为IgG2b类,且其抗原结合位点基本一致。细胞染色体分析表明,3株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,远高于骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数,从遗传角度证实获得了杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,这3株细胞经多次冻存复苏和传代培养,不同代次细胞上清中的抗体效价均在1∶104～1∶105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的性能稳定。

重组猪干扰素β在CHO细胞中的表达及其抗口蹄疫病毒活性的研究

构建猪IFN-β重组真核表达质粒pcDNA3.1-PoIFN-β,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达;通过CHO细胞表达系统,成功分泌表达和制备纯化的rPoIFN-β。通过CCK-8试验,分析rPoIFN-β对细胞的毒性,结果显示纯化的rPoIFN-β对细胞无明显毒性;采用VSV/PK-15系统检测rPoIFN-β抗病毒活性效价,结果显示其抗病毒活性效价为4.54×10^(7)U/mg;制备的rPoIFN-β可显著抑制O型和A型FMDV在PK-15细胞的复制,表现出较强的抗病毒活性;通过分析rPoIFN-β对细胞ISGs的诱导作用,发现rPoIFN-β能够显著刺激12种ISGs的表达。研究结果表明,本试验制备纯化的rPoIFN-β具有较低的细胞毒性和较高的抗病毒活性效价,为口蹄疫防控制剂的开发和研究提供了基础数据。