表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。

猪Viperin蛋白对PEDV复制的影响

为了研究干扰素刺激基因Viperin对猪流行性腹泻病毒复制的影响,试验构建猪源Viperin基因的慢病毒表达载体,并进行慢病毒的包装和转导,对重组蛋白质进行Western-blot鉴定,同时研究过表达Viperin对PEDV感染的影响。结果表明:成功构建了猪Viperin基因的慢病毒表达载体,命名为pWPXL-Vip,且测序结果进一步表明Viperin基因被正确克隆。免疫荧光检测结果显示猪Viperin在Vero细胞质中表达。Western-blot结果显示在分子质量约75 ku处有1条特异性条带,Viperin在Vero细胞中正确表达。用PEDV感染稳定表达Viperin的Vero细胞,荧光定量PCR结果显示过表达Viperin能够提高病毒拷贝数。说明本试验成功构建了猪Viperin基因的慢病毒表达载体,且表达的Viperin蛋白能够促进PEDV复制。

基于光谱法及分子对接技术的猪血红蛋白与儿茶素相互作用研究

为增强猪血红蛋白(PHb)结构的稳定性,提高其应用价值,将天然抗氧化剂儿茶素(C)与PHb进行互作,以期稳定PHb的结构。采用紫外可见光谱、荧光光谱、傅里叶红外光谱和扫描电镜研究C与PHb的相互作用,并通过分子模拟对接技术表征儿茶素-猪血红蛋白复合物(C-PHb)的形貌和结构。结果表明,添加C前后,PHb的紫外吸收光谱发生明显变化;荧光光谱结果表明,C能有效猝灭PHb内源荧光且为自由发生的静态猝灭,猝灭常数(Kq)为7.5×10^(10)L·mol^(-1)·s^(-1),作用力主要为范德华力、氢键和疏水作用力。同时,相较于PHb,C-PHb的蛋白质二级结构发生改变,表现为β-折叠含量增高,α-螺旋、β-转角和无规卷曲含量降低。此外,分子对接模型进一步验证了C可与PHb进行相互作用。综上,C可与PHb互作以稳定其结构。本研究可为制备具有抗氧化性质的PHb复合物提供理论支持和可行性依据。

低蛋白质饲粮中添加益生菌对育肥猪生长性能、粪便菌群组成和代谢组特征的影响

本试验旨在探讨低蛋白质饲粮中添加益生菌对育肥猪生长性能、粪便菌群组成和代谢组特征的影响。选取平均体重为(80.56±0.45)kg的长×大育肥猪90头,随机分为3组,分别为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组3圈(重复),每圈10头(阉公猪与母猪各占1/2)。对照组饲喂含14%蛋白质的常规蛋白质饲粮,试验Ⅰ组饲喂含12%蛋白质的低蛋白质饲粮,试验Ⅱ组饲喂添加益生菌的低蛋白质饲粮(每千克低蛋白质饲粮中含2.0×10^(9)CFU乳酸菌和2.0×108CFU酿酒酵母)。预试期5 d,正试期42 d。结果显示:1)与对照组和试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ组的平均日增重显著提高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05)。2)与对照组和试验Ⅱ组相比,试验Ⅰ组粪便中颤螺菌目、毛螺菌目、毛螺菌科、瘤胃球菌科、UCG-005、粪杆菌属、小杆菌属和福涅氏菌属的相对丰度显著降低(P<0.05),解纤维素菌属的相对丰度显著增加(P<0.05);试验Ⅱ组粪便中毛螺菌目、乳杆菌目和毛螺菌科的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)。3)试验Ⅰ组与对照组、试验Ⅱ组与对照组以及试验Ⅰ组与试验Ⅱ组粪便样品间分别发现9、37和41种差异代谢物;不同组间差异代谢物的KEGG通路富集分析显示共有27条富集通路;与对照组和试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ组粪便中5-羟基吲哚乙酸的表达量显著升高(P<0.05),肾上腺素的表达量显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组粪便中N-乙酰-L-苯丙氨酸的表达量显著低于对照组和试验Ⅱ组(P<0.05);试验Ⅱ组粪便中L-谷氨酰胺、D-葡萄糖醛酸的表达量显著高于试验Ⅰ组(P<0.05)。4)与对照组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组粪便中总支链脂肪酸、总短链脂肪酸、氨氮和粪臭素含量显著减少(P<0.05);与试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ组粪便中乙酸含量显著减少(P<0.05),丁酸含量显著增加(P<0.05)。综上所述,在低蛋白质饲粮中添加益生菌(乳酸菌和酿酒酵母)可改善育肥猪的肠道菌群结构及其代谢物表达,减少粪便中总短链脂肪酸、氨氮和粪臭素含量,提高育肥猪的平均日增重和饲料转化效率。

低蛋白饲粮补充不同氨基酸对育肥猪生长性能、血清生化指标、养分表观消化率及氮排放的影响

试验旨在研究低蛋白饲粮补充不同氨基酸对育肥猪生长性能、血清生化指标、养分表观消化率及氮排放的影响。选取体重约75 kg“杜×长×大”育肥猪120头,随机分为3个处理,每个处理设4个重复,每个重复10头猪。对照组饲喂粗蛋白(CP)水平为13.45%的饲粮,试验Ⅰ组和Ⅱ组饲粮CP水平为10.41%,试验Ⅰ组补充赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸4种氨基酸,试验Ⅱ组补充赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸6种氨基酸。试验期28 d。结果表明:与对照组相比,试验Ⅰ组平均日采食量和平均日增重显著降低(P<0.05),试验Ⅱ组平均日采食量和平均日增重低于对照组(P>0.05);试验Ⅰ组和Ⅱ组血清尿素氮含量显著降低(P<0.05);各组养分表观消化率均无显著差异(P>0.05);试验Ⅰ组和Ⅱ组食入氮、尿氮排放、总氮排放显著降低(P<0.05),试验Ⅰ组和Ⅱ组粪氮排放降低,氮沉积率和氮表观生物学价值升高(P>0.05)。研究表明,低蛋白饲粮(CP=10.41%)补充6种氨基酸对育肥猪生长性能无负面影响,且可以有效降低氮排放。

发酵棉籽粕对育肥猪生长性能、蛋白酶活性及肠道小肽转运载体的影响

文章旨在研究发酵棉籽粕对育肥猪生长性能,蛋白酶活性及肠道小肽转运载体的影响。试验将200头体重(36.49±1.34)kg的育肥猪分为4组,每组5个重复,每个重复10只。各组分别使用0%、1%、2%和4%的发酵棉籽粕替换豆粕。试验为期100d,预饲期10d,正试期90d。在初重无显著差异的基础上(P>0.05)添加2%和4%的发酵棉籽组肥猪的FBW显著降低3.12%和3.83%(P<0.05);添加2%和4%的发酵棉籽组肥猪的ADG显著降低4.44%和5.57%(P<0.05);添加2%和4%的发酵棉籽组肥猪的料重比显著提高5.51%和5.57%(P<0.05)。添加2%和4%的发酵棉籽组肥猪的十二指肠胃蛋白酶活性显著降低(P<0.05);添加4%的发酵棉籽组肥猪的空肠胃蛋白酶和胰蛋白酶活性均显著降低(P<0.05)。添加2%和4%的发酵棉籽组肥猪的十二指肠CAT1和PepT1基因表达显著降低(P<0.05);添加1%~4%的发酵棉籽组肥猪的空肠CAT1和PepT1基因表达显著降低(P<0.05);添加1%~4%的发酵棉籽组肥猪的回肠CAT1基因表达显著降低(P<0.05)。总之,发酵棉籽可能通过下调肥猪肠道蛋白酶活性和小肽转运载体mRNA表达影响肠道蛋白和氨基酸消化吸收,从而抑制育肥猪生长。

低蛋白质低豆粕多元化饲粮是养猪节粮增效的关键技术

通过补充适宜种类和数量的工业合成晶体氨基酸,低蛋白质饲粮可以精准满足猪快速生长所需的氨基酸营养需求,避免蛋白质饲料浪费及减少粪、尿氮排放。低蛋白质低豆粕多元化饲粮是以低蛋白质饲粮生产技术为基础,依据各种能量饲料和蛋白质饲料的可利用养分等,配制的原料种类多、养分互补性强、营养平衡度高的低豆粕饲粮。低蛋白质低豆粕多元化饲粮可有效增强猪对饲粮中营养物质的消化、吸收和沉积,降低饲粮中豆粕、玉米等原料的用量,对节粮增效及提高养猪效率具有重要意义。本文从研究与应用进展、对生猪养殖效率的影响、合成氨基酸与天然氨基酸效率对比、氨基酸数量需求情况及产能等方面分析,综述了猪低蛋白质低豆粕多元化饲粮技术、应用效果及前景,以期为相关研究及应用工作提供一定的参考和帮助。

儿茶素-糖基化猪血红蛋白对肉糜品质的影响及抑菌作用

为加强猪血红蛋白(porcine hemoglobin,PHb)的应用,将糖基化猪血红蛋白(glycosylated porcine hemoglobin,G-PHb)与儿茶素互作得到具有抗氧化和抑菌作用的儿茶素-糖基化猪血红蛋白(catechin complex glycosylated porcine hemoglobin,CG-PHb),将其添加至猪肉肉糜中研究肉糜动态流变性、水分分布、pH值、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)、羰基值以及PHb、G-PHb和CG-PHb的抑菌作用。结果表明,PHb经糖基化处理及与儿茶素复合增加了肉糜中不易流动水的峰比例,有效地改善肉糜的凝胶性能;添加PHb、G-PHb和CG-PHb均可以降低肉糜在贮藏过程中蛋白质分解成氨类和碱性物质的速度,抑制pH值的增加;经CG-PHb处理后的肉糜样品与空白组相比TVB-N增加量由21.18 mg/100 g降为11.88 mg/100 g(P<0.05);TBARS值和羰基值也显著低于其他组。相较于PHb和G-PHb,CG-PHb对金黄色葡萄球菌的抑菌率平均提高了47.54%和33.40%(P<0.05),对大肠杆菌的抑菌率平均提高了14.93%和7.05%(P<0.05),CG-PHb表现出了较好的抑菌效果。研究表明添加CG-PHb能够改善肉糜品质,同时CG-PHb具有良好抑菌性能,为PHb的开发利用提供理论指导。

表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定

【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。

黄原胶浓度对猪血浆蛋白-黄原胶基油凝胶结构及功能性质的影响

本文以猪血浆蛋白和黄原胶为原料,采用泡沫模板法制备一种可以物理吸附大豆油且具有一定机械强度的油凝胶,并对其热稳定性进行分析。结果表明,随着黄原胶浓度的增加,猪血浆蛋白-黄原胶共混溶液体系的表观粘度和泡沫稳定性显著增加,起泡性显著降低(P<0.05)。微观结构结果表明,黄原胶添加导致猪血浆蛋白-黄原胶含水泡沫体系的气泡尺寸以及大气泡数量降低,冻干后冷冻泡沫凝胶样品内部排列有序且整体孔隙较为致密,孔洞清晰可见,能够较好地将液态油捕获在内部结构中。与此同时,基于猪血浆蛋白和黄原胶形成的油凝胶具有较强的油约束能力以及更接近半固体的流变学行为。随着黄原胶浓度的增加,吸油能力呈现先增大后减小的趋势,且在0.6%黄原胶浓度时具有最大值(46.43 g/g),此时油凝胶的油约束能力为84.69%。另外,黄原胶添加能够显著增加油凝胶在不同温度下的油约束能力(P<0.05),从而增强其热稳定性。因此,0.6%黄原胶添加可制备出较为稳定的猪血浆蛋白-黄原胶基油凝胶,为以蛋白质和多糖为凝胶剂的新型油凝胶的开发以及在低脂产品中的应用奠定一定的理论基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

荣昌猪、约荣猪和杜长大三元猪肉色与肌红蛋白相关性研究

【目的】探究荣昌猪、大约克夏猪×荣昌猪(约荣猪)与杜洛克猪×长白猪×大白猪(杜长大三元猪)的肉色和肉中肌红蛋白含量差异,验证肉色与肌红蛋白的相关性,为商品猪肉色评价提供基础数据。【方法】采集荣昌猪(n=15)、约荣猪(n=20)、杜长大三元猪(n=20)背最长肌肉样,结合肉色度值、可见吸收光谱及公式对宰后45 min、6 h、12 h和24 h荣昌猪、约荣猪、杜长大三元猪的肉色和肌红蛋白含量分别进行测算,并探究猪肉色和肌红蛋白的关联性。【结果】荣昌猪肉红度值显著高于杜长大三元猪(P<0.05);宰后45 min,3种猪肉亮度值显著低于其他时间点(P<0.05)。3种猪肌红蛋白扫描光谱在543和580 nm处出现氧合肌红蛋白特征峰,峰高显示荣昌猪>约荣猪>杜长大三元猪。宰后45 min,荣昌猪肉中总肌红蛋白含量显著高于约荣猪和杜长大三元猪(P<0.05),氧合肌红蛋白含量显著高于杜长大三元猪(P<0.05),高铁肌红蛋白相对含量显著低于约荣猪和杜长大三元猪(P<0.05)。宰后24 h,荣昌猪肉中高铁肌红蛋白含量及氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白相对含量均显著高于45 min和6 h(P<0.05)。相关性分析显示,红度值、总肌红蛋白和氧合肌红蛋白含量之间存在显著高度正相关(P<0.05)。【结论】荣昌猪肉因红度值高、总肌红蛋白含量高和高铁肌红蛋白相对含量低而肉色更鲜红,猪肉色优劣与肌红蛋白含量及其氧化还原状态密切相关。

棉籽蛋白的加工工艺与营养成分及其在猪生产中的应用研究进展

我国是饲料生产大国,配合饲料产量位居世界第一,但豆粕等重要的蛋白质饲料原料在很大程度上依赖于进口,所以开发可替代豆粕的高品质蛋白质饲料原料尤为重要。我国棉花资源丰富,棉花加工过程中的副产物棉籽粕富含蛋白质和氨基酸,由棉籽粕进一步加工处理得到的棉籽蛋白,粗蛋白质含量高、氨基酸较平衡,可以在一定程度上替代豆粕和降低饲料成本。本文总结了棉籽蛋白的分类、加工工艺、营养成分、猪的有效能和氨基酸消化率及其在猪生产中的应用研究,可为棉籽蛋白的深层次开发和高效利用提供参考。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

柯乐猪异常乳腺组织的TMT蛋白组学分析

【目的】基于串联体量标记(TMT)定量蛋白组学技术探讨柯乐猪母猪乳腺发育的调控机制,为选育工作提供依据。【方法】选取乳腺发育正常和异常的柯乐猪母猪各3头,采集乳腺组织,利用TMT定量蛋白组学技术探究正常和异常乳腺组织的差异表达蛋白,筛选与乳腺发育相关的差异关键蛋白,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。【结果】从柯乐猪乳腺组织中共筛选出474个差异表达蛋白,包括245个上调蛋白、229个下调蛋白;基因本体(GO)功能注释和富集分析显示,差异表达蛋白主要富集在上皮细胞分化、皮肤形成和肾小管上皮细胞分化等生物学过程中,主要分布在胞外区和细胞外空隙中,参与调节肽酶抑制剂活性和肽链内切酶活性;京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示,差异表达蛋白主要富集在补体系统、过氧化物酶体增殖物激活受体和金黄色葡萄球菌感染等信号通路上;结合差异表达蛋白互作网络分析,筛选出10个核心差异表达蛋白[上调蛋白有P14287(骨桥蛋白)、F1RXF9(角蛋白25)、I3LDS3(角蛋白10)、Q75QW1(上皮细胞黏附分子)、A0A5S8KLN1(丛生蛋白)、F1RW75(桥粒素),下调蛋白有A0A286ZT13(白蛋白)、P06867(血纤维蛋白溶酶原)、F1SCC9(含丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的蛋白)、P50447(α-1-抗胰蛋白酶)]。【结论】采用TMT定量蛋白组学技术能有效筛选出母猪正常和异常乳腺组织中的差异表达蛋白。

猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的低温诱导表达研究

为了提高猪圆环病毒3型(PCV-3)Cap重组蛋白的可溶性表达量,试验采用PCR方法扩增PCV-3 Cap基因,将其插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-32a(+)-Cap,再将重组原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,分析不同浓度IPTG和温度的诱导表达效果,并通过Western-blot鉴定重组蛋白。结果表明:PCR扩增出大小为645 bp的Cap基因片段,与预期结果一致;构建的重组原核表达载体pET32a(+)-Cap可在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,重组蛋白分子量约为43.1 ku;不同浓度IPTG诱导表达可溶性蛋白的表达量不同,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时重组蛋白可溶性表达量较高;37℃诱导时重组蛋白主要在沉淀中表达,而20℃诱导时重组蛋白主要在上清液中表达;表达的重组蛋白能与带His标签的抗体特异性结合。说明试验成功构建了重组蛋白,低温诱导可获得了更多的可溶性蛋白。

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立

Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(PCV2)的主要结构蛋白,构成病毒的核衣壳,是PCV2的主要免疫保护性抗原,在PCV2血清学诊断中具有重要意义。本研究根据PCV2的ORF2基因序列设计特异性引物,通过PCR方法扩增得到去核定位信号肽的ORF2基因,并通过同源重组将其克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,经测序鉴定成功获得重组质粒pCold-Ⅰ-Cap。将重组质粒转化至感受态细胞BL21中进行表达,通过考马斯亮蓝染色以及免疫印迹试验检测Cap蛋白的表达,同时将纯化后的重组蛋白通过优化反应条件建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组去核定位信号肽Cap蛋白可溶性表达且可以与PCV2阳性血清特异性结合,通过探索不同蛋白包被浓度以及不同一抗孵育浓度初步建立了间接ELISA检测方法,进而为PCV2抗体的有效监测奠定基础。

猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。