猫细小病毒CC-1株NS1全基因的克隆及序列分析

根据GenBank中收录的猫细小病毒(FPV)CU-4株基因序列设计引物,扩增本实验室分离保存的FPV CC-1株NS1基因,并进行序列测定。结果表明,该毒株NS1基因序列长度约为2.35 kb,该基因的阅读框总长为2007 bp,编码668个氨基酸。该序列与FPV193/70株、PLI-IV株、TU-2株、CU-4株、94-1株和X J-1株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.0%、98.9%、98.8%、98.7%、98.6%、99.4%,氨基酸的同源性分别为98.8%、98.7%、98.5%、98.7%、98.5%、99.3%。该毒株与犬细小病毒(CPV)、貂细小病毒(MEM)、大鼠细小病毒(RPV)、猪细小病毒(PPV)、鹅细小病毒(GPV)、鼠细小病毒(MVM)NS1的进化树分析表明,它与MEM和CPV的亲缘关系比较近,与PPV的亲缘关系较远。

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPVFM株和GPVB株全基因序列 ,设计并合成一对引物 ,分别对MDPVGD株和GPVGD株的结构蛋白基因 (VP1)进行PCR扩增 ,并克隆到pMD18_T载体 ,筛选到重组质粒并测序。通过对MDPVGD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析 ,这两种病毒VP1基因大小均为 2 199bp ,核苷酸序列同源性为 87% ,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大 ,同源性仅为 6 4 %。另外对MDPVGD株和GPVGD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较 。

犬瘟热、猫细小病毒、犬腺病毒弱毒株的理化特性及生物学试验

以鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）、猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）、狗肾传代细胞（ＭＤＣＫ）从引进的疫苗中分别分离到犬瘟热ＣＤＶ－Ａ株、猫细小病毒ＦＰＶ株、犬腺病毒ＣＡＶ１株。对三个弱毒株的细胞病变规律，形态特征，病毒滴度，理化特性，核酸型，血清学交叉反应，本动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验。鉴定结果表明。

实验大鼠细小病毒H-1株抗体检测能力验证结果评价

目的了解全国实验动物检测相关实验室在大鼠细小病毒H-1株抗体检测项目的技术水平,发现并解决检验中存在的问题,促进各实验室加强质量管理,提高检测水平。方法不限定检测方法,推荐各参加实验室参照国标规定的方法,对统一发放的大鼠血清样品进行细小病毒H-1株的定性检测,结果以阳性或阴性表示,与预期结果均一致判为满意结果,不完全一致或逾期未反馈结果判为不满意。结果来自13个省市自治区的18家单位报名参加本次比对实验,1家单位因故退出,实际参加并发放比对样品共17家单位,其中16家在规定时间反馈了检测结果,1家未在规定时间反馈结果,反馈结果的16个实验室检测结果均为满意,占参加比对实验室的94%,其中13个实验室使用外购试剂盒,14个实验室采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测,仅2个实验室对阳性结果进行了复检。结论全国各实验动物检测机构大鼠细小病毒H-1株总体检测能力较高,个别实验室因故未参加或逾期未反馈结果,检测能力有待考察。

猪细小病毒自然弱毒N株非结构蛋白NS1基因原核表达

为进一步探讨猪细小病毒自然弱毒N株(PPV-N株)的分子病原学机理,根据GenBank上已发表的PPV全基因组序列(登录号NC_001718)设计1对引物,通过PCR方法扩增获得PPV-N株NS1全长基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进而构建原核表达重组质粒pET32a-NS1,并在BL21(DE3)pLysS中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为90.0 kDa;Western blotting分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,且具有免疫原性,可作为PPV临床鉴别诊断抗原。

猪细小病毒GZ株NS1基因主要抗原区的克隆与序列分析

为了解猪细小病毒（PPV）的分子流行病学和遗传变异等，对送检的疑似猪细小病毒感染病料进行了病毒分离鉴定，将分离毒株同步接种于ST细胞，并对分离病毒分别进行了血凝试验、中和试验、病毒理化特性和病毒核酸类型检测等鉴定；同时设计1对扩增PPVNS1基因主要抗原区的特异性引物，扩增、克隆和分析了分离毒株的NS1基因主要抗原区序列。结果表明：从送检的疑似猪细小病毒感染病料中成功分离出1株PPV贵州毒株，并将其命名为Gz株；扩增的NS1基因主要抗原区序列长度为1131bp；遗传进化分析表明，PPVGZ株与国内分离的GX株、N株、SR-1株、PPV2010株、s-1株和YL株的核苷酸序列同源性达到98．3％以上，推导的氨基酸序列的同源性为97．9％～100％，表明NS1基因序列比较保守，PPV的NS1基因主要抗原区基因克隆测序可以作为诊断猪细小病毒感染的依据。

犬细小病毒YBYJ株NS1基因的克隆及序列分析

为了克隆YBYJ株犬细小病毒（CPV）NS1基因，并对其进行序列分析，试验选择GenBank中的CPV—NS1基因（登录号为NC_001539）序列设计1对特异性引物，以延边大学预防兽医学实验室分离的CPVYBYJ株为毒株，经PCR扩增得到NS1基因，将其克隆至pMD18-Tsimple载体，然后进行基因测序和序列分析。结果表明：YBYJ株CPV—NS1基因大小为2007bp，编码668个氨基酸，与国内外其他10株CPV—NS1基因的核苷酸同源性为98．0％-99．7％，氨基酸同源性为96．7％-99．7％。提示CPV—NS1基因变异较小，遗传进化相对稳定。

番鸭细小病毒YL08分离株NS1基因的克隆及序列分析

为了了解番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白(NS1)基因的分子生物学特性,试验根据GenBank中发布的其他MDPV基因序列,设计并合成可扩增NS1基因的特异性引物,利用PCR方法从MDPV阳性病料中获得MDPV YL08株NS1基因,将其克隆至载体p ET-32a(+)中,构建重组质粒p ET-32a-NS1,并进行同源性分析和构建系统发育进化树。结果表明:MDPV YL08分离株NS1基因全长为1 884 bp,编码627个氨基酸;MDPV YL08分离株NS1基因与国内外已发表的MDPV分离株核苷酸序列同源性为98.5%~99.4%,该分离株与福建株亲缘关系最近。

猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析

[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。

猪细小病毒S-1A株对细胞的适应性及其培养条件的优化

将猪细小病毒S-1A株在不同的细胞中培养,测定病毒含量,以确定适合猪细小病毒S-1A株增殖的细胞。结果表明:猪细小病毒S-1A株能在猪肾传代细胞系(PK-15)、猪肾原代细胞(PK)、猪睾丸细胞(ST)和仔猪肾细胞(IBRS-2)中生长增殖,不能在幼仓鼠肾细胞系(BHK-21)、绿猴肾细胞(Vero)和鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖;当ST细胞生长至2/3单层时,将猪细小病毒S-1A株种毒液100倍或1000倍稀释后接种ST细胞,37℃培养96~144 h,获得的病毒载量最高。

猫细小病毒洛阳分离株VP2蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】研究旨在对猫细小病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)洛阳分离株VP2蛋白进行原核表达和鼠源多克隆抗体制备。【方法】根据已公布的FPV VP 2基因序列(GenBank登录号:EU018143.1)设计1对特异性引物,以洛阳地区7例疑似FPV感染猫粪便为样本提取DNA,对VP 2基因进行PCR鉴定及测序,利用Mega 11.0软件对VP 2基因进行遗传进化分析;应用在线软件预测分离株VP2蛋白结构特征并找出优势抗原表位,克隆VP2优势抗原(sVP2)并连接pET-32a(+)载体,构建pET-32a-sVP2重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行诱导表达,对重组蛋白表达条件进行优化,并使用SDS-PAGE与Western blotting方法进行鉴定;将pET-32a-sVP2用镍柱亲和层析蛋白纯化后免疫BABL/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价。【结果】分离得到1株FPV,命名为LY-1。遗传进化分析发现,该毒株属于FPV-G2亚群,与北京株(GenBank登录号:MT270581)亲缘关系最近。生物信息学分析显示,VP2属于稳定膜内蛋白,无信号肽与跨膜区,在N-端具有丰富的B细胞抗原表位(1―800 bp,sVP2)。试验成功构建pET-32a-sVP2重组质粒并表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约50 ku,主要以包涵体形式存在,在30℃、1 mmol/L IPTG诱导6 h蛋白表达量最佳;Western blotting结果表明,重组蛋白能与鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明,该重组蛋白抗体效价为1∶128000,能够较好地识别免疫原sVP2和原核表达VP2蛋白并发生特异性反应。【结论】本试验克隆获得FPV sVP2片段,并制备多克隆抗体,为进一步研究VP2在FPV复制和致病过程中的作用及建立诊断FPV方法提供参考。

猪细小病毒1型突变株分离鉴定及全基因组进化分析

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养,经电镜观察和IFA试验进行鉴定,通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增,SnapGene V4进行序列拼接和比对,利用DNAMAN V6对基因组末端5′UTR和3′UTR二级结构进行展示和比较,应用MEGA V7进行遗传进化分析,最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒,均鉴定为PPV1型毒株,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致,其中5′-UTR序列高度保守,呈Y型结构;而3′-UTR呈U型结构,个别碱基有所差异;VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示,突变株生长趋势相对较快,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。

几个猫细小病毒毒株间抗原性和基因性的比较

用病毒ＤＮＡ限定酶及抗猫泛白细胞减少症病毒（ＦＰＬＶ）单克隆抗体对源于猫、水貂及犬的１４株猫细小病毒（ＦＰＶ）进行抗原和基因（差异）的比较测定。且在抗原性及基因特性方面与日本的ＦＰＬＶ及水貂肠炎病毒（ＭＥＶ）毒株进行比较。最近从中国东北部分离出来的几株ＭＥＶ和狗细小病毒（ＣＰＶ，“新”抗原型）具更多的相同之处。由于抗原及基因特性所决定我们还是把一份从普通猫粪便中分离出的一个毒株看作ＣＰＶ。用限定酶（ＨｉｎｆＩ）消化显示。早期分离到的一株“新”抗原型ＣＰＶ和分离到的“旧”抗原型ＣＰＶ毒株具有相似的消化片断。包括上述提到的这些特性的测定结果显示．在ＦＰＶ的不同亚种间存在抗原的多相性和基因的多型性。

PPV_(S-1)A株保存期研究及免疫原性测定

为了确保疫苗质量,保证生产用种毒的稳定性,将猪细小病毒PPVS-1A株的干毒和湿毒分别在-20℃和-70℃保存,每12个月取样一次,分别进行病毒含量测定、红细胞凝集价测定、乳鼠安全试验和豚鼠抗体检测。结果病毒含量均大于107.25;红细胞凝集价为1∶1024;乳鼠接种未见不良反应;豚鼠抗体检测HI均不低于1∶32。确定猪细小病毒PPVS-1A株湿毒在-20℃的保存期为24个月,在-70℃的保存期为48个月;猪细小病毒PPVS-1A株冻干毒在-20℃的保存期为36个月,在-70℃的保存期为60个月。猪细小病毒PPVS-1A株毒保存期长,具有良好的安全性和免疫效力。

FPLV、CPV、MEV非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2遗传特征分析

为了解猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、犬细小病毒(CPV)、水貂肠炎病毒(MEV)氨基酸遗传演化规律,探索细小病毒在不同种属动物间跨种传播过程中病毒蛋白氨基酸差异特点以及毒株流行病学特征。通过搜集确定为CPV、MEV的粪便病料,PCR扩增克隆非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2基因,并参考GenBank中其他细小病毒毒株,对其推导的氨基酸序列构建遗传发育树,进行病毒的遗传进化分析,同时对细小病毒流行毒株的非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2基因编码的氨基酸差异位点进行了归纳总结。遗传进化分析结果表明,细小病毒不同种属以及同种属各亚型之间NS1蛋白氨基酸同源性高于VP2蛋白,但氨基酸差异较小。FPLV和MEV NS1和VP2蛋白原本保守的氨基酸,在遗传进化的过程中出现与CPV一致的突变(NS1蛋白第247、350、545、595位氨基酸;VP2蛋白第101、232、411位氨基酸)。FPLV、MEVVP2蛋白氨基酸在进化过程中不同于CPV,但是更加稳定。我国CPV分离毒株中,CPV-2a亚型VP2蛋白Ile324位氨基酸独特位点仍然存在。

抗猫泛白细胞减少症免疫球蛋白的制备工艺研究及质量监控

猫泛白细胞减少症病毒 (Feline pauleukopinia virus,FPV)同义名为猫细小病毒 ,猫传染性肠炎病毒 ,猫瘟病毒 [1 ]。以下简称“猫瘟病毒”。该病是猫的一种急性 /致死性白细胞减少。我国许多省市区均有发生本病流行的的报道。 1985年南京农业大学兽医系从病体内分离病毒成功 [3]。在自然条件下 ,猫瘟病毒除感染猫外 ,还侵害虎、豹、狮、熊猫、鼬等动物 ,发病和死亡率较高 [1、6 ]。在疫苗接种方面 ,对本病能产生一定效果 ,但由于诸多原因 ,该病发生和流行仍呈上升势头 ,迄今国内外尚未见到较理想的有效治疗药物。有鉴于此 ,我们因地制宜 ,选用陕西关中富有的特产大型毛驴作为免疫动物 [5] ,研制出用于预防和治疗猫瘟病毒性肠炎的有效药物—抗猫瘟免疫球蛋白 (Ig G)生物制剂 ,经过五年反复试验 。

番鸭细小病毒YL08株VP1基因重组分析

为确定番鸭细小病毒(MDPV)YL08株的起源和进化过程,基于VP1全基因序列,将YL08株与其他6株MDPV中国大陆株进行了基因重组分析。系统进化树分析表明:7株MDPV可分成3组,MDPV-Ⅰ、MDPV-Ⅱ和MDPV-Ⅲ。MDPV-Ⅰ仅仅包括1株MDPV,为黑龙江的YL08株;MDPV-Ⅱ包括3株MDPV,为广东GD株以及福建P株和P1株;MDPV-Ⅲ包括2株MDPV,为广西MDPV-GX5株和上海SAAS-SHNH株。通过Sim Plot软件和系统进化树进行的重组分析表明,MDPV YL08株来源于MDPV-Ⅱ和MDPV-Ⅲ之间的重组。这是首次发现在MDPV VP1基因间存在重组现象。

猫疱疹病毒1型HR-1毒株的分离鉴定及致病性分析

从哈尔滨市某宠物医院疑似感染1型猫疱疹病毒发病猫的眼、鼻拭子中分离到1株病毒,经过电镜观察、分子生物学、血清学和动物回归试验鉴定,分离到的病毒为猫疱疹病毒1型,命名为HR-1株。HR-1可在猫肾细胞(CRFK)上产生典型细胞病变,病毒滴度可达到108 TCID50/mL。提取病毒基因组DNA经过gD引物扩增后,得到1条1 125 bp大小的特异性条带,经测序表明其与C-27毒株gD基因序列相似性达100%。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,接种HR-1的单层CRFK细胞出现特异性荧光。电镜观察可见圆形、有囊膜、直径约为150 nm的病毒颗粒。为了解该毒株的毒力及致病性,通过感染中国家猫进行致病性试验。结果表明,HR-1为强毒株,对家猫的致死率为100%;HR-1感染家猫后主要表现为眼结膜炎和鼻气管炎;通过实时荧光定量PCR能从感染家猫的眼、鼻拭子中检测到病毒粒子核酸,并且于感染后4~6 d病毒核酸达到最高峰。本试验为猫疱疹病毒的诊断和致病机制的研究提供了参考价值.

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒(FPV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数(R2)均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。