茯苓多糖对LPS诱导猫肾细胞炎症的保护作用研究

【目的】研究茯苓多糖(Poria cocos polysaccharide,PCP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的猫肾细胞(crandell rees feline kidney,CRFK)炎症反应的保护作用及抗炎机制。【方法】通过MTT法检测不同浓度PCP(5、10、15、25、35、45μg/mL)和LPS(20、40、60、80、100、125、150μg/mL)对CRFK细胞活力的影响;用不同浓度PCP处理LPS诱导的CRFK炎症模型,观察PCP干预后的细胞形态变化,通过硝酸还原酶法和流式细胞术检测CRFK中一氧化氮(NO)释放和细胞凋亡情况;利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测细胞炎症和凋亡相关基因以及蛋白表达水平。【结果】5~25μg/mL PCP对CRFK无毒性,且可逆转LPS刺激后CRFK细胞形态变化。25μg/mL PCP可显著降低LPS刺激后CRFK内NO释放和细胞凋亡率(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,不同浓度PCP能够显著降低LPS诱导CRFK中IL-6、TNF-α、Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bid和Bax mRNA表达量,显著上调Bcl-2 mRNA表达量(P<0.05)。Western blotting结果显示,LPS诱导的CRFK中TLR4、NF-κB、Caspase3和Caspase9蛋白表达水平显著升高(P<0.05),PCP处理能显著降低TLR4、NF-κB、Caspase3和Caspase9蛋白表达量(P<0.05)。【结论】PCP能够通过调控细胞凋亡抑制LPS诱导的CRFK炎症损伤,其作用机制可能与抑制TLR4-NF-κB信号通路有关。研究结果为PCP治疗CRFK炎症提供了新的靶点和试验依据。

山羊干扰素-τ的原核表达及其在猫肾细胞中的抗病毒效果检测

为制备重组山羊干扰素-τ(rGoIFN-τ)并检测其在猫肾细胞(F81)中的抗病毒活性,本研究根据大肠杆菌密码子偏好性优化合成GoIFN-τ基因后,将该基因克隆至pColdII载体,获得重组质粒pColdII-rGoIFN-τ,经鉴定正确后将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE鉴定,利用镍离子亲和层析柱纯化蛋白,纯化的rGoIFN-τ经western blot检测后采用BCA法测定蛋白浓度。结果显示,rGoIFN-τ在大肠杆菌DE3中得到可溶性高效表达,表达量占菌体总蛋白的28.70%,纯化后蛋白浓度为100 mg/L,且具有良好的反应性。采用CCK8法检测rGoIFN-τ对F81细胞活力的影响,结果显示,其在0.0055 ng/mL~5500 ng/mL时对细胞的活力基本无影响。以水疱性口炎病毒(VSV)为模式病毒感染已与rGoIFN-τ共孵育24 h后的F81细胞,通过微量细胞病变抑制法检测rGoIFN-τ在F81/VSV系统中的抗病毒活性,结果显示,rGoIFN-τ抗VSV活性单位数为4.55×105 U/mg。经不同浓度的rGoIFN-τ(55 ng/mL、550 ng/mL、5500 ng/mL)共孵育后的F81细胞分别感染VSV,经Reed-Muench法和荧光定量PCR法检测rGoIFN-τ的抗病毒能力,结果显示,感染24 h和48 h后rGoIFN-τ可显著抑制VSV的病毒滴度和VSV-L基因转录水平(P<0.05),尤其是5500 ng/mL rGoIFN-τ的作用最佳。综上所述,本研究实现了rGoIFN-τ原核可溶性高效表达,并首次证实其在猫F81细胞中具有较好的抗病毒活性,为进一步研究rGoIFN-τ在猫抗病毒性感染中的作用奠定了基础。

利巴韦林对猫细小病毒感染诱导F81猫肾细胞中凋亡相关基因表达的影响

试验将F81猫肾细胞随机分为对照组、药物组(猫细小病毒(FPV)+利巴韦林)、病毒组(FPV感染),采用实时荧光定量PCR的方法,检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Caspase 3等凋亡相关基因的相对表达量。结果显示,与对照组相比,病毒组细胞凋亡增加,抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达受到抑制,Bax mRNA和Caspase 3mRNA的相对表达量均有不同程度的上调。药物组细胞的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达水平显著高于病毒组(P<0.05),且总体呈上调状态,但72h时Bcl-xl表达量减少;而药物组的促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达量显著低于病毒组(P<0.05),48h前,Bax的表达量呈递减状态,72h时检测结果显示药物组Bax表达量相比对照组显著上调(P<0.05),但仍显著低于病毒组(P<0.05);与对照组相比,病毒组和药物组Caspase 3的表达量在72h时显著上调(P<0.05)。综上所述,利巴韦林可在基因水平通过上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl和下调促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达来抑制FPV感染诱导的F81猫肾细胞凋亡发生。

麦冬水提物对猫肾细胞的影响研究

麦冬是我国传统中药之一,兼备保健和治疗作用。为了探究麦冬能否应用在宠物食品中,本试验以不同浓度的麦冬水提物(3.91~8000μg/mL)为受试药物,从细胞的形态、增殖、凋亡及周期4个方面对猫肾细胞(F81)进行安全性评价。结果表明:在试验浓度范围内,麦冬水提物没有抑制F81的增殖,且在3.91~62.5μg/mL的浓度范围内,凋亡及周期结果经统计学分析均无显著性差异,与对照组接近,且细胞形态良好。说明在一定浓度范围内,麦冬水提物对F81细胞无毒害作用。

不同毒力水貂阿留申病毒在猫肾细胞中的增殖特性及凋亡特性的比较研究

试验旨在对不同毒力水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)在猫肾细胞(feline kidney cell,CRFK)中的增殖规律及其诱导细胞凋亡情况进行比较研究。将标准毒株AMDV-G及分离到的野毒株AMDVDL124、AMDV-DL125、AMDV-QD2、AMDV-QD3、AMDV-ZJ3接种CRFK细胞,应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、TCID50测定技术研究病毒在细胞中的复制及表达情况,同时检测病毒诱导的细胞凋亡情况。间接免疫荧光结果显示,5株野毒株荧光着色趋势差异不大,均在感染后12h出现荧光,随感染时间延长荧光增多,AMDV-G荧光出现时间比野毒株晚,但病毒感染后72h几乎所有细胞均出现荧光;实时荧光定量PCR结果显示,基因组复制趋势大致相同,AMDV-DL125感染后3h复制开始,AMDV-G感染后24h复制才开始并呈快速增长趋势,但感染后72h均达到峰值。TCID_(50)检测结果表明,0~12h为病毒感染潜伏期,AMDV-G感染后60h达到峰值,野毒株均在感染后72h达到峰值,但是6株病毒均能在感染后48~72h维持较高的感染滴度,其后随细胞崩解而降低。SPSS 23.0统计软件分析凋亡检测结果显示,与对照组相比,野毒株感染细胞后2~12h诱导细胞凋亡差异显著(P<0.05),AMDV-G诱导细胞凋亡差异明显低于野毒株,但是诱导细胞凋亡时间较野毒株长,在感染后24h仍对细胞凋亡有较明显的诱导作用,但是各病毒诱导的细胞凋亡主要集中在2~12h。该结果为AMDV的培养、鉴定及致病机理研究提供一定参考。

敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究

猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,瞬时转染猫肾细胞(CRFK)中,24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后,细胞中的绿色荧光消失,对细胞进行PCR和测序,结果显示:3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入,造成移码突变,导致f APN不能正常表达,表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建,命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞,48 h后通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FIPV N蛋白的表达;将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞,在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸(维甲酸)诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、Toll样受体3(TLR3)、干扰素β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的转录水平。IFA结果显示:感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光,未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录(P<0.0001);RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述,f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用,并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据,并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实验基础。

水貂阿留申病毒诱导猫肾细胞(CrFK)凋亡

为研究水貂阿留申病毒(AMDV)在体外诱导猫肾细胞(CrFK)凋亡情况,用AMDV-G株感染CrFK细胞,采用CCK-8法检测CrFK细胞感染后的细胞存活率,用AO/EB染色法检测CrFK细胞核的形态变化,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,并通过分光光度计法检测细胞凋亡执行分子Caspase-3活性。结果显示,AMDV-G株感染可导致CrFK细胞增殖率下降,产生明显的形态学凋亡特征;流式细胞术检测结果显示,AMDV-G株感染可引起CrFK细胞凋亡并随着感染时间的延长凋亡率增加,同时Caspase-3活性显著升高。上述结果表明,AMDV-G株在体外能够诱导CrFK细胞凋亡,为进一步研究AMDV致病机理奠定基础。

水貂病毒性肠炎病毒在猫肾细胞上培养过程中补增细胞对病毒滴度的影响

笔者在F81-KL细胞培养MEV过程中,通过比较在不同时间(72 h^96 h)添加不同细胞数对MEV滴度的影响,探讨添加细胞的实际效果和经济价值。结果表明:MEV在培养过程中,72 h^96 h按8×104个/cm^2添加新鲜细胞可提高病毒滴度,添加的细胞数对产量影响不明显。说明在MEV培养过程中人为添加敏感细胞在到一定程度上可提高病毒滴度并可稳定收获。