F81细胞无血清悬浮驯化后培养猫泛白细胞减少症病毒的研究

为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(F81),通过对贴壁F81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养F81细胞系。研究建立的F81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^(6)cells/mL时,培养48 h后细胞密度可达到7.02×10^(6)cells/mL。对培养猫泛白细胞减少症病毒工艺进行摸索,确定最佳接毒工艺为同步接毒法,初始接毒细胞密度为1×10^(6)cells/mL、MOI为3.5×10^(-2),培养72 h后收毒,病毒滴度可达到10^(7.25)TCID_(50)/0.1 mL。该方法使用同源细胞系且未添加动物血清,为猫泛白细胞减少症生物制品生产降低了下游生产纯化难度,同时降低了生产成本,可显著提高产品核心竞争力。研究结果可为其他猫用生物制品相关研究提供参考。

利巴韦林对猫细小病毒感染诱导F81猫肾细胞中凋亡相关基因表达的影响

试验将F81猫肾细胞随机分为对照组、药物组(猫细小病毒(FPV)+利巴韦林)、病毒组(FPV感染),采用实时荧光定量PCR的方法,检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Caspase 3等凋亡相关基因的相对表达量。结果显示,与对照组相比,病毒组细胞凋亡增加,抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达受到抑制,Bax mRNA和Caspase 3mRNA的相对表达量均有不同程度的上调。药物组细胞的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达水平显著高于病毒组(P<0.05),且总体呈上调状态,但72h时Bcl-xl表达量减少;而药物组的促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达量显著低于病毒组(P<0.05),48h前,Bax的表达量呈递减状态,72h时检测结果显示药物组Bax表达量相比对照组显著上调(P<0.05),但仍显著低于病毒组(P<0.05);与对照组相比,病毒组和药物组Caspase 3的表达量在72h时显著上调(P<0.05)。综上所述,利巴韦林可在基因水平通过上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl和下调促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达来抑制FPV感染诱导的F81猫肾细胞凋亡发生。

5株猫杯状病毒中国分离株的细胞适应性及遗传进化分析

将CH-JL1、CH-JL2、CH-JL3、CH-JL4、CH-SH 5株猫杯状病毒中国分离株分别在F81细胞上连续传至15代。细胞传代前,测定病毒的细胞半数感染量(TCID_(50)),再以0.1 MOI的感染复数接种细胞。采用RTPCR方法扩增FCV各代次的ORF2基因片段并测序,用DNASTAR和MEGA软件分析其氨基酸变异和遗传进化特点。试验结果显示,细胞适应传代后,FCV各代次毒株滴度逐渐稳定,均位于10^(-9)TCID_(50)/mL^10^(-10)。TCID_(50)/mL之间。ORF2基因测序表明,FCV传代后氨基酸变异位点包括CH—JL1的P57S和G494R、CH-JL3的S440L和N519D、CH—JL4的V614I、CH—SH的K448R。遗传进化分析表明CH—JL2和CH-JL3处于同一进化分支上,同源性为95.9%;CH-JL1和国内FB-NJ-13株、CH-SH和国内GD株分别在一个进化分支,CH-JL4和国外F65株遗传关系较近。5株猫杯状病毒在F81细胞传代后滴度较高,稳定性良好,为将来FCV疫苗株的研发奠定了基础。

一株猫杯状病毒FCV-LH的分离、纯化及鉴定

从青岛崂山区一家宠物医院中疑似感染猫杯状病毒的猫鼻咽喉拭子中,利用F81细胞分离到一株FCV后,进行RT-PCR检测,测定TCID_(50)及其理化性质,并用蚀斑克隆对其进行纯化、RT-PCR复检,测定效价。结果显示,FCVLH的TCID_(50)为1×10^(-8)/0.1mL,蚀斑克隆纯化三代后,病变稳定,RT-PCR进行复检为阳性。将纯化后的病毒液按Reed-Muench法计算TCID_(50)后稀释到10^(-5.0)TCID_(50)/0.1mL以滴鼻+点眼的方式进行攻毒,攻毒后发病率为80%,出现眼鼻分泌物增多、流涎、口腔溃疡等典型临床症状,证明该毒株致病性较强。

水貂病毒性肠炎病毒在猫肾细胞上培养过程中补增细胞对病毒滴度的影响

笔者在F81-KL细胞培养MEV过程中,通过比较在不同时间(72 h^96 h)添加不同细胞数对MEV滴度的影响,探讨添加细胞的实际效果和经济价值。结果表明:MEV在培养过程中,72 h^96 h按8×104个/cm^2添加新鲜细胞可提高病毒滴度,添加的细胞数对产量影响不明显。说明在MEV培养过程中人为添加敏感细胞在到一定程度上可提高病毒滴度并可稳定收获。

利巴韦林对猫细小病毒诱导的细胞凋亡抑制作用

为了研究利巴韦林对感染猫细小病毒(FPV)细胞的影响,试验将猫肾细胞(F81细胞)随机分为对照组、病毒组、药物组,采用MTT法检测细胞的生长曲线,Hochest 33258染色观察细胞的细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期。结果表明:Hochest 33258染色试验中药物组与病毒组差异不显著(P>0.05);药物组细胞的增殖活性始终高于病毒组,但低于对照组;流式细胞仪检测利巴韦林治疗后48小时G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞变化不大;72小时G2/M期细胞增多;药物组与病毒组细胞的流式检测在G1峰的左侧均出现典型的亚G1峰,但各时间点药物组细胞的凋亡指数均明显低于病毒组。说明利巴韦林能抑制FPV诱导的细胞凋亡,具有一定的治疗指导意义。

利巴韦林对感染猫细小病毒细胞的治疗作用研究

为了研究利巴韦林对感染猫细小病毒(FPV)细胞的作用,试验采用F81猫肾细胞,在猫细小病毒感染后不同时间点收集细胞,应用MTT法检测细胞的增殖活性;利用利巴韦林毒性试验,摸索出药物对细胞的安全浓度;利用不同浓度利巴韦林处理已攻毒细胞,MTT法检测细胞的增殖活性,酶标法检测细胞氧化损伤情况。结果表明:利巴韦林能明显抑制FPV引起的细胞死亡率,病毒组过氧化氢(H2O2)含量和细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性在各个采样时间点均显著高于对照组,显示细胞氧化损伤严重,致使LDH从细胞内渗出。病毒组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)含量均明显低于对照组,揭示病毒所引起的细胞氧化损伤进一步激发了细胞自体保护性ROS清除机制,最终导致了细胞内SOD活性和GSH含量的下降。利巴韦林药物组LDH活性和H2O2含量都呈现升高趋势,但其增长幅度明显低于病毒组;在各采样时间点,药物组细胞内SOD活性和GSH含量均明显(P<0.05)高于病毒组,低于对照组。说明利巴韦林对感染猫细小病毒细胞具有一定的修复治疗效果。