湖南省猬迭宫绦虫的线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列重构猬迭宫绦虫与其它绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得各样品株的pcox1和pnad1序列长度一致,分别为396和566bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。由于猬迭宫绦虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为猬迭宫绦虫的种群体遗传学研究和其相关疾病的诊断奠定基础。

ELISA法检测猬迭宫绦虫抗体的研究

目的 探讨研制猬迭宫绦虫特异性诊断方法。 方法 将已克隆的编码猬迭宫绦虫幼虫半胱氨酸酶的基因重组到表达载体内 ,制备高纯度的基因工程抗原 ,以此基因工程抗原制成酶联免疫吸附试剂盒 ,检测 6例裂头蚴病患者血清。 结果与结论 基因工程抗原能与裂头蚴病患者血清发生很强的特异性反应 ,而不能与囊虫病患者血清发生反应。此方法的建立为裂头蚴病的特异性诊断奠定了基础。

欧猬迭宫绦虫全长cDNA文库构建及鉴定

应用SMART方法成功构建欧猬迭宫绦虫成虫全长cDNA文库,文库的重组率为95.5%,库容量为1.06×106;平均插入片段长度约为1.4kb。选取48个随机阳性克隆测序,去除<450bp序列后获得36个有效表达序列标签(EST),平均长度为674bp,其中单基因簇(unigene)比例为58.3%(21/36);26条具有同源性序列的EST中15条有或可能有5′末端,全长性比率为57.7%(15/26)。文库质量良好,可用于大规模EST测序。

猬迭宫绦虫幼虫一个含重复序列的cDNA的分子克隆

目的：研究猬迭宫绦虫幼虫－裂头蚴的某些蛋白抗原的基因结构。方法：用鼠抗猬迭宫绦虫裂头蚴多克隆抗体筛选裂头蚴ｃＤＮＡ文库，筛选出的阳性克隆经亚克隆，测序后，用微机分析其一级结构。并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交实验检测与ｃＤＮＡ杂交的ｍＲＮＡ长度。结果：从ｃＤＮＡ文库中筛选出一个长度为１０８４ｂｐ的克隆，此克隆的开放读码框为８２８ｂｐ，编码２７６个氨基酸。开放读码框内有一个由１２３个核苷酸组成的重复单位，此重复单位在开放读码框内重复５次。重复单位编码的４１个氨基酸内疏水性氨基酸占５３．７％。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示在１．１ｋｂ处有一个很强的杂交带，１．７ｋｂ处有一个弱的杂交带。１．１ｋｂ处的杂交带与ｃＤＮＡ克隆的长度几乎相等。结论：裂头蚴在宿主体内移行或停留时，这些含重复序列的抗原性多肽可能作为逃避抗原，使裂头蚴在体内逃避免疫系统的杀伤作用。

猬迭宫绦虫线粒体cox3基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)基因部分序列(pcox3)的遗传变异情况。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pcox3,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,同时利用DNAStar5.0中的Megalign程序进行同源性分析,再用Phylip 3.67程序MP法绘制系统发育树,并与GenBank中已知猬迭宫绦虫相应基因序列进行比对分析。结果显示,所获得的pcox3序列长度一致,均为264bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分支,来自湖南省的猬迭宫绦虫pcox3序列有微小差异。本研究结果为猬迭宫绦虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。

猬迭宫绦虫裂头蚴线粒体nad1基因部分序列的多态性研究

从湖南省4个不同地区的黑斑蛙大腿肌肉中采集猬迭宫绦虫裂头蚴作为研究对象,用引物Nad1u及Nad1d扩增猬迭宫绦虫裂头蚴的nad1基因片段,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的MeGalign程序进行同源性分析。结果显示猬迭宫绦虫裂头蚴nad1序列均为570 bp。研究结果为猬迭宫绦虫裂头蚴进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。

猬迭宫绦虫广东分离株线粒体pcox1基因的克隆及序列分析

为阐明猬迭宫绦虫广东分离株的遗传变异情况,本研究利用PCR技术扩增了猬迭宫绦虫的部分细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(pcox1)基因,经SSCP筛选出带型差异的代表样品进行测序,经系统发育树表明,广东分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。同时研究表明猬迭宫绦虫pcox1序列种内相对保守,又存在一定种间差异,可作为种间遗传变异研究的标记,研究结果为进一步研究猬迭宫绦虫的群体遗传结构奠定了基础。

雷丸及吡喹酮对猬迭宫绦虫裂头蚴感染性及超微结构的影响

目的了解雷丸及吡喹酮对猬迭宫绦虫裂头蚴感染性及超微结构的影响。方法从黑斑蛙体内检获裂头蚴,用20、40和80 mg/ml雷丸粉末混悬培养液以及20、80和320μg/ml吡喹酮培养液分别体外培养裂头蚴4、12和24 h,单纯培养液培养4、12和24 h为感染对照组。168只昆明小鼠均分为21组（每组8只）,每组小鼠经口感染相应条件培养后的裂头蚴各5条/鼠。感染后1周剖杀各组小鼠,计数每鼠裂头蚴检出数,并计算每组小鼠的减虫率。扫描电镜和透射电镜分别观察不同培养处理后的裂头蚴超微结构变化。结果小鼠感染经40和80 mg/ml雷丸粉末混悬液分别培养4、12和24 h的裂头蚴1周后,每组小鼠裂头蚴平均检出数分别为1.6、1.0和0.3条,0.3、0和0条,均显著低于对照组（4.1、3.5和3.3条）（P〈0.05）,且两组间差异有统计学意义（P〈0.05）;减虫率分别为60.0%、71.4%和90.1%,92.7%、100%和100%,且两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。小鼠感染经320μg/ml吡喹酮溶液分别培养4、12和24 h的裂头蚴1周后,每组小鼠裂头蚴平均检出数分别为1.9、1.3和0.4条,与对照组间差异均有统计学意义（P〈0.05）;减虫率分别为53.7%、62.9%和87.9%,显著高于20μg/ml吡喹酮处理组的14.6%、2.9%和6.1%以及80μg/ml吡喹酮处理组的24.4%、17.1%和24.2%（P〈0.05）。扫描电镜和透射电镜观察可见,经40 mg/ml雷丸粉末混悬液培养4 h以及320μg/ml吡喹酮溶液培养4和12 h后,裂头蚴虫体出现轻度挛缩;经40 mg/ml雷丸粉末混悬液培养12和24 h,虫体微毛凝集、融合或脱落,质膜破裂,石灰小体释出,皮质组织受损;经80 mg/ml雷丸粉末混悬液培养4-12 h,虫体损害逐渐加重,至24 h,裂头蚴组织结构严重受损,无法辨清;经320μg/ml吡喹酮溶液培养24 h,虫体前端挛缩明显,质膜水肿、泡状隆起,石灰小体形态改变,糖原颗粒耗损,分泌颗粒增加及焰细胞核质浓缩。经20 mg/ml雷丸粉末混悬液、20和80μg/ml吡喹酮溶液培养4、12和24 h的裂头蚴虫体与对照组相比,超微结构无明显改变。结论随着吡喹酮和雷丸体外培养浓度的增加以及时间的延长,裂头蚴对小鼠的感染性逐渐降低,并引起虫体广泛的组织结构损伤;雷丸的作用较吡喹酮明显。

吡喹酮抗体内培养欧猬迭宫绦虫裂头蚴的作用与评价

目的探讨吡喹酮经灌胃及注射两种方式抗SD大鼠体内欧猬迭宫绦虫裂头蚴的效果。方法将50只SD大鼠每只感染5条欧猬迭宫绦虫裂头蚴,培养两周后随机分组进行药物治疗。灌胃治疗组:使用吡喹酮药物浓度分别为600 mg/kg、1 200 mg/kg、1 800 mg/kg及2 400 mg/kg进行灌胃治疗7 d,灌肠对照组以单纯植物油灌肠;注射治疗组:配制30%吡喹酮注射液以注射剂量分别为0.2 ml和0.5 ml进行注射治疗3 d及6 d,注射对照组以无菌生理盐水注射。疗程结束后剖杀大鼠,计算减虫率,如大鼠体内剩余虫体则进行切片及HE染色。结果吡喹酮作用于大鼠体内裂头蚴,各用药组减虫率与对照组减虫率差异均有统计学意义(P<0.05),其中灌胃法以1 800 mg/kg剂量组减虫率最高,注射法以0.5 ml 6 d组减虫率最高。虫体切片染色后观察,体壁有明显的断裂,甚至深入基质区。结论吡喹酮抗体内裂头蚴虫体有良好的效果,其抗虫机制可能与吡喹酮对裂头蚴组织结构的破坏而致虫体死亡有关。

不同宿主来源猬迭宫绦虫线粒体pcox1、pcox3和prrn S基因的系统发育分析

为了分析不同宿主猬迭宫绦虫的遗传多样性和种系发育关系,本研究通过PCR方法扩增了湖南省7种不同宿主体内采集的7株猬迭宫绦虫(其中3株为裂头蚴)的线粒体pcox1、pcox3和prrn S基因并测序,采用DNAStar 5.0软件分析其与其他绦虫相应基因序列的同源性;利用DnaSP V6.12软件计算并分析各基因序列的多样性;利用邻接法绘制pcox1、pcox3和prrn S基因的遗传进化树。PCR扩增及测序结果显示,7株虫株均扩增出了分别为396 bp(pcox1)、362 bp(pcox3)和280 bp(prrn S)的目的片段,且3种基因碱基差异率分别为0~2.27%、0~1.10%和0~1.79%。同源性分析结果显示,本研究的7株猬迭宫绦虫与已报道的其他猬迭宫绦虫线粒体pcox1、pcox3和prrn S基因序列的同源性分别为97.20%~100.00%、98.90%~100.00%和97.90%~100.00%;与其他绦虫线粒体pcox1、pcox3和prrn S基因序列同源性分别为66.70%~84.10%、51.70%~72.10%和63.80%~87.10%。基于基因序列单倍型数(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异(K)数据的基因序列多样性分析结果显示,3个基因变异率为pcox1>prrn S>pcox3。系统进化树结果显示,7株虫株的pcox1、pcox3和prrn S基因均与已知猬迭宫绦虫相应基因聚类在同一分支,与其他绦虫所属分支相距较远,且基于pcox1、pcox3和prrn S基因均可以将猬迭宫绦虫聚为两个分支。上述结果表明,上述3种基因尤其是pcox3基因均可以作为研究不同宿主来源猬迭宫绦虫遗传变异的分子标记及用于其虫种的鉴定,且猬迭宫绦虫的遗传变异与宿主无关。该研究是国内首次通过线粒体基因探究不同宿主猬迭宫绦虫的遗传进化关系,为猬迭宫绦虫的分子鉴定、分类和群体遗传研究奠定了基础。

湖南省猬迭宫绦虫的线粒体nad5和rrnS基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)和核糖体小亚基基因(rrnS)部分序列(prrnS)的遗传变异情况,并用pnad5和prrnS序列重构猬迭宫绦虫与其他绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pnad5和prrnS,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mega4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。结果显示,所获得的pnad5和prrnS序列与预期(片段的)长度一致,分别为531bp和328bp。种系发育树表明,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。结果表明,由于猬迭宫绦虫pnad5和prrnS序列种内相对保守,种间差异较大,均可作为种间遗传变异研究的标记。

湖南省猬迭宫绦虫ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

利用聚合酶链反应（PCR）扩增猬迭宫绦虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,所获得的ITS及5.8S rDNA序列总长存在一定差异,为1 369~1 393 bp,包含部分的18、28S及全部的ITS-1（662~687 bp）5、.8S（138 bp）及ITS-2（457~475 bp）序列。由于猬迭宫绦虫ITS序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记。

猬迭宫绦虫裂头蚴感染小鼠皮下肌肉组织β1转化生长因子含量变化的观察

目的探讨β1转化生长因子(TGF-β1)在猬迭宫绦虫(Spirometra erinacei)裂头蚴感染小鼠皮下肌肉组中的表达情况及意义。方法对采自野生王锦蛇(Elaphe carinata)的裂头蚴进行形态学观察和PCR检测。昆明小鼠80只,用数字随机表法挑选40只,雌雄各半作为实验组,剩余40只为对照组。用蛇源裂头蚴经口喂饲实验组小鼠,5条/鼠。于喂饲后第7、14、28、56天各随机剖杀10只,分别收集含有裂头蚴寄生的皮下肌肉组织,用中性甲醛固定,制作石蜡切片。HE染色后,观察裂头蚴感染病灶周围的病理变化和纤维化程度;免疫组化检测皮下肌肉中TGF-β1的含量变化。对照组不喂饲裂头蚴,检测时间及方法同实验组。结果PCR扩增获得约400 bp的目的条带。测序结果显示,该裂头蚴COX1基因与Gen Bank中的猬迭宫绦虫序列一致性为99.12%。HE染色检查,皮下肌肉中的裂头蚴被炎性囊壁所包裹,虫体与囊壁之间形成穴腔,穴腔有时出现少许的浆液或血液。囊壁最里面的区域有薄层的纤维蛋白、坏死的碎片,壁中早期以中性粒细胞浸润为主,也有嗜酸粒细胞、巨噬细胞、浆细胞等,随着病程的进展,炎性囊壁逐渐扩大,壁中以慢性炎性细胞浸润为主,囊壁周围是宿主的组织细胞,纤维结缔组织增生明显,并有不同程度的纤维化。免疫组化检查结果显示,TGF-β1的主要表达部位为裂头蚴周围的炎症反应带和纤维结缔组织增生部位。TGF-β1相对表达量在感染后逐渐增高,于感染第28天达峰值(0.654 5±0.045 5),第56天时明显下降。在感染后第7~56天,实验组的TGF-β1水平为(0.502 6±0.008 2)^(0.346 8±0.030 4)与同期对照组的(0.270 0±0.001 6)^(0.274 0±0.005 1)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论小鼠感染猬迭宫绦虫裂头蚴早、中期,TGF-β1表达水平均提高,其免疫抑制作用不利于清除和控制皮下肌肉组织中的裂头蚴。

猬迭宫绦虫27ku半胱氨酸蛋白酶基因的表达模式研究

目的了解半胱氨酸蛋白酶(CP)基因在猬迭宫绦虫成虫及裂头蚴不同部位及裂头蚴不同感染时期的时空表达模式。方法收集安顺地区野生王锦蛇体内猬迭宫绦虫裂头蚴。将24只昆明小鼠随机分成8组,每组3只,以5条裂头蚴/只感染小鼠,于感染后30min^14d剖杀1组小鼠,收集感染小鼠体内的裂头蚴,以10条/只感染3只幼犬,于感染后1个月剖杀幼犬,收集成虫。利用实时定量PCR检测猬迭宫绦虫成虫和裂头蚴不同部位及不同感染时期裂头蚴CP基因的表达情况。结果小鼠经口感染裂头蚴30min后腹腔内查见穿过胃肠壁的裂头蚴;感染后30min^6h,裂头蚴主要见于胃肠腔、胃肠壁和腹腔内;感染24h,有少量的裂头蚴移行至小鼠皮下肌肉组织;感染7d后,多数裂头蚴移行至皮下肌肉组织寄生。实时荧光定量PCR检测CP基因在成虫及裂头蚴的不同部位均有表达,但成虫不同部位的表达量均低于幼虫时期。成虫不同部位的表达量依次为孕节>头节>成节,裂头蚴不同部位的表达量依次为体段>头段>尾段。裂头蚴感染小鼠30min时CP基因表达量下调,感染6h时达到峰值,随后下降,感染14d时降至最低。结论 CP基因在猬迭宫绦虫裂头蚴感染初期及裂头蚴体段和成虫孕节高表达,提示CP可能参与猬迭宫绦虫的生长、发育、入侵及移行等过程。

猬裂头蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

目的克隆、表达猬裂头蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)基因,并分析其生物学特性。方法提取蛇源猬裂头蚴总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因,克隆入pMD-19T载体,测序正确后将27kDa-CP基因亚克隆入表达载体pET-28a(+),构建pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒,转入大肠埃希菌Transetta(DE3)中,经IPTG诱导,表达目的蛋白27kDa CP。用镍离子柱亲和层析法纯化目的蛋白。表达产物用SDS-PAGE及Western Blotting进行分析,并运用NCBI和ExPASy等有关的生物信息学分析工具,对27CP基因及其编码蛋白进行预测和分析。结果 CP基因序列的开放阅读框长为1 011bp,去除信号肽序列长954bp,登录到GenBank,获得登录号ANA52569。该基因编码一个含317个氨基酸的蛋白多肽,属于Peptidase_C39_like超家族,理论分子量约35 669.9Da,等电点5.92。pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒经IPTG诱导后,蛋白在大肠埃希菌中成功表达,经纯化后的蛋白利用Western blotting检测,证明与预期大小相符,且与猬裂头蚴感染阳性血清有较好的结合反应。结论成功克隆、表达了猬裂头蚴27kDa CP基因,获知CP基因及其编码的氨基酸序列和生物信息学。

阴囊曼氏裂头蚴病1例

本期"人裂头蚴病和无头蚴病:Ⅰ.病原学的过去和现在"一文指出,"医学专著、文献和词典中裂头蚴病的病名,一直被无头蚴病替代","已被习惯使用的曼氏迭宫绦虫(S.mansoni)应予废弃"。参照该文,裂头蚴病的英文名为plerocercoidosis,无头蚴病才是sparganosis。长期以来,国内研究者常用的曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)实际上是欧猬迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)的同种异名,其幼虫所致的疾病为裂头蚴病。本文所谓"曼氏裂头蚴病"的正确英文名应为"Spirometra erinacei-europaei plerocercoidosis"。"曼氏裂头蚴病"一词似应废止不用。

虫种特异性基因检测小鼠无虫病理组织裂头蚴感染的可行性研究

目的研究用细胞色素C氧化酶1基因(cox1)及内转录间隔区1(ITS-1)特异性序列检测小鼠无虫病理组织中裂头蚴感染的可行性。方法 6~8周龄昆明小鼠20只,采用随机抽签法分为感染组(15只)和未感染组(5只),感染组小鼠经口感染蛇源裂头蚴(5条/只),未感染组不作任何处理。感染后第14天剖杀小鼠,取感染组小鼠皮下含裂头蚴肌肉组织(含虫组织)、去除裂头蚴肌肉组织(无虫组织)及未感染组小鼠相应部位肌肉,制作组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)染色后观察。用改良的蛋白酶K消化法提取未染色肌肉组织切片的DNA,PCR扩增cox1(2对引物,对应cox1-1和cox1-2片段)和ITS-1序列。选取从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1进行克隆并测序,与Gen Bank中猬裂头蚴序列(KJ418421、KF990161、GQ999947)进行比对。以猪囊尾蚴感染的小鼠肌肉组织同法制作切片并提取DNA,评价cox1和ITS-1 PCR扩增的特异性。结果感染组含虫组织DNA经1次PCR即可扩增出414 bp(cox1-1)、151 bp(cox1-2)、822 bp(ITS-1)的条带。感染组无虫组织DNA第1次PCR未扩增出条带,以第1次PCR产物为模板再次PCR,扩增出相同大小的3条条带。未感染组DNA第1次和第2次PCR均未扩增出条带。序列比对结果显示,从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1序列与KJ418421、KF990161、GQ999947序列的同源性分别为98.2%、99.1%、99.1%。猪囊尾蚴感染组织DNA没有扩增出条带。结论以cox1和ITS-1序列为靶序列进行重复PCR,能鉴定小鼠无虫病理组织裂头蚴感染。