猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。方法根据GenBank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。结果利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccⅢ限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。结论初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法，并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针，使用分子生物学方法制备质粒标准品，建立SV5实时荧光定量PCR方法；对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定；并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法；该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL，灵敏度为6．8copy／μL，批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％，批间CV为1．52％-12．38％，而且方法特异性好；在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

猴副流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为对易感动物以及相关生物材料和生物制品进行猴副流感病毒(SV5)的快速病原检测,根据SV5病毒SH基因序列,设计了1对引物,建立了检测SV5的RT-PCR方法,通过优化确定了RT-PCR体系的最佳工作条件。核酸序列分析显示,所扩增片段与GenBank数据库中报道的SV5病毒株WR-21005序列同源性达到97%,证明该方法特异。敏感性分析显示,该方法可检测的最小RNA浓度为2.1 ng/μL,能检出的最小病毒滴度为3.98CCID50/0.1 mL。初步将该方法运用于猴、地鼠、常用传代细胞和猴源生物制品的检测,在所检测的样品中均未检出猴副流感病毒核酸序列。结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于猴副流感病毒(SV5)的诊断和分子流行病学调查。

人副流感病毒2型感染恒河猴肾细胞后内参基因的筛选

目的评价阳性药物利巴韦林治疗人副流感2型病毒(HPIV-2)感染恒河猴肾细胞(LLC-MK2)后甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(Hprt1)、β-肌动蛋白(β-actin)、肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、β2微球蛋白(B2M)5种内参基因的表达稳定性。方法HPIV-2感染LLC-MK248 h和72 h,采用real-time PCR法测定病毒组、利巴韦林治疗组和正常细胞对照组中上述5种内参基因的表达水平,利用geNorm程序对它们的稳定性进行评价。结果5种内参基因均能稳定表达,其中GAPDH和Hprt1在感染后48 h稳定度相同,且最稳定;Ppia和Hprt1在感染后72 h稳定度相同,且最稳定。结论Hprt1、GAPDH和Ppia是抗HPIV-2药物体外筛选和研究HPIV-2与LLC-MK2相互作用最理想的内参基因。