猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明:建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10~2~0.5×10~6 copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。

猴痘病毒感染的神经系统表现研究进展

在过去的一年内,猴痘的爆发已成为全球关注的问题。猴痘是猴痘病毒感染引起的人畜共患病,除典型的皮疹症状以外,猴痘病毒感染还可引起一系列神经系统表现,潜在的机制可能包括感染后免疫介导的神经系统损伤,以及病毒直接侵入神经系统。本文围绕猴痘病毒感染的神经系统表现进行综述,以促进早期识别、诊断猴痘病毒感染神经系统并发症,及时采取相应的防治措施。

猴痘病毒新型蛋白疫苗制备及其诱导抗体能力评估

目的构建有效的猴痘病毒(MPXV)和痘苗病毒(VACV)蛋白疫苗,并对其诱导抗体的活性进行初步评估。方法采用融合蛋白表达技术构建MPXV-A29-Fc和VACV-A27-Fc蛋白疫苗,酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)体外检测蛋白结合抗体的能力,BALB/c雌性小鼠体内评估不同剂量蛋白疫苗诱导抗体的效价。结果MPXV-A29-Fc和VACV-A27-Fc蛋白均能与A29单克隆抗体结合,蛋白疫苗免疫小鼠后,不同剂量组中的小鼠血清均可交叉识别MPXV-A29和VACV-A27蛋白,三针免疫可诱导更强的交叉免疫应答,三针免疫后,不同的血清稀释度下,低剂量组的IgG抗体结合强度均与高剂量组相当,可达到高剂量组的免疫效果。结论本研究初步构建有效的MPXV和VACV新型蛋白疫苗MPXV-A29-Fc和VACV-A27-Fc,在小鼠体内可诱导特异性抗体反应和交叉抗体反应,可为猴痘病毒的疫苗设计提供新的思路和方法。

猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价

【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。

猴痘病毒B20R蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序列进行优化,人工合成B20R基因并将其分别克隆至表达载体pET-28a和pET-32a以构建原核表达载体;以构建的2种原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后使用SDSPAGE和Western blotting检测融合蛋白B20R的表达情况。通过控制变量法优化融合蛋白B20R的诱导表达条件,使用Ni柱亲和层析进行纯化;以纯化的融合蛋白B20R经腹腔注射免疫昆明小鼠,定期采集昆明小鼠血样,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】将B20R基因克隆至表达载体pET-32a能成功构建原核表达载体pET-32a-B20R,经IPTG诱导后,可在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达出融合蛋白B20R,且主要以不可溶的包涵体形式进行表达。融合蛋白B20R最佳诱导表达条件为37℃下以0.6 mmol/L IPTG诱导12 h,Ni柱亲和层析纯化的最佳咪唑洗脱浓度为40 mmol/L。以纯化的融合蛋白B20R接种免疫昆明小鼠,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫,且至免疫第42 d仍然维持较高的抗体水平,抗体效价高达1∶409600。【结论】构建的猴痘病毒B20R蛋白原核表达载体可在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式成功表达出融合蛋白B20R,且融合蛋白B20R具有良好的免疫原性,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫。

广东地区人工驯养灵长动物的病毒组特征及猴痘病毒筛查

目的明确广东地区灵长动物携带病毒群落的结构特征,并评估重要人兽共患病毒猴痘病毒(MPXV)通过人工驯养灵长动物传入我国的风险。方法在广东省14个地级市的20个野生动物救护中心或动物园采集灵长动物样品,通过Illumina测序技术鉴定广东地区人工驯养灵长动物携带病毒组的结构特征;并通过荧光定量PCR方法,对MPXV进行检测,以确认MPXV经广东省人工驯养灵长动物传入的风险。结果共收集灵长动物口咽拭子和粪便489份。高通量测序结果显示,广东地区人工驯养灵长动物粪便中的病毒组结构复杂且具有地区差异,其中丰度最高的是Alphaflexiviridae和Virgaviridae的成员,其次为Parvoviridae和Genomoviridae成员。荧光定量PCR结果显示,广东省内野生动物救护中心或动物园的灵长动物全部为MPXV阴性。结论广东省人工驯养灵长动物携带病毒引起动物源性人兽共患病的风险极低,且MPXV通过广东省人工驯养灵长动物传入我国的风险几乎为零。

成都市锦江区污水中猴痘病毒的监测及基因特征分析

目的 调查成都市锦江区污水中猴痘病毒含量,并对其进行分型溯源。方法 2023年7~9月对成都市第九污水处理再生水厂未经消杀处理的污水进行24 h间断采样,共采集26个样本。用聚乙二醇沉淀法将水样从105 mL浓缩到0.6 mL后,提取核酸,用实时荧光聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)法检测猴痘病毒,用猴痘病毒假病毒标准物质制备标准曲线计算相对浓度。对阳性的样本进行猴痘病毒全基因组扩增子测序。结果 8个样本检测出猴痘病毒阳性,检出率30.8%,均为西非分支Ⅱb C.1型。各分离株基因与报道的临床阳性株非常相似,与2022年猴痘疫情暴发的基因组密切相关。各分离株序列之间也非常相似,相似性为99%以上。结论 污水中的猴痘病毒都与报道的临床毒株高度相似,可以推定污水中的猴痘病毒均来自于患者或携带者的人体脱落物或排泄物。污水中猴痘病毒浓度与阳性报告病例的发生率基本呈正相关,表明污水监测是监测猴痘感染传播趋势的可行方法。

实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究

目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。

猴痘病毒的环境稳定性及相关消毒研究进展

世界卫生组织2024年8月14日宣布,猴痘疫情构成“国际关注的突发公共卫生事件”。此次疫情由猴痘病毒变异株Ⅰb引起,该毒株传播速度更快,且可能具有更高的致死率。猴痘病毒主要通过直接接触感染性体液或病变(疹子、水泡、脓疱、伤口、疤痕)传播,也可通过接触被猴痘病毒污染的物品传播。本综述总结了温度、物体表面类型、有无蛋白质污染等影响猴痘病毒在环境中存活时间的数据,还总结了相关痘病毒的消毒方法和消毒效果的数据,旨在为猴痘病毒的消毒研究和预防猴痘病毒传播提供参考。

猴痘病毒B.1谱系遗传分支、毒力基因及蛋白功能

2022年以来,猴痘疫情在全球暴发和流行。相较以往的猴痘病毒,2022年流行的猴痘毒株传播能力和宿主适应性等明显增强,猴痘B.1谱系毒株已成为全球猴痘疫情流行的主要毒株。为此,本文对猴痘病毒B.1谱系遗传分支、毒力基因及蛋白功能进行综述,并就部分基因产物的蛋白功能进行了注释,以期为猴痘疫情的科学防控提供参考。

猴痘病毒A33R、L1R、B5R和A27L蛋白表达及生物学特性

为给猴痘病毒的抗原制备和疫苗制备奠定基础,原核表达带有GST标签的融合蛋白A33R、L1R、B5R和A27L,并简要分析这四个蛋白的一些生物学特性。用PGEX-6P-1为载体,构建重组融合蛋白表达质粒;用大肠杆菌DE3感受态细胞转化重组质粒后,在体外诱导表达和纯化;纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳,做考马斯亮蓝染色分析并用WB进行验证。最后,通过生物信息学方法分析4个蛋白的生物学特性,用ExPAsy在线软件中的ProtParam工具和ProtScale工具分别分析其理化性质和亲疏水性,用SignalP4.1 service在线软件分析其信号肽,成功构建了4个重组目的蛋白表达质粒,并成功诱导表达并纯化出带GST标签的目的蛋白。通过生物信息学的方法分析可知,4个蛋白均为疏水蛋白,除了B5R,A33R、L1R和A27L均为分泌蛋白,为猴痘病毒的抗原制备和疫苗制备提供理论基础。

猴痘病毒感染的流行病学及检测技术的研究进展

猴痘病毒是一种具有传染性的病毒,该病毒与天花同属,均为正痘病毒属。猴痘病毒感染的临床症状与天花相似,但病情相比天花要轻,大多数通过治疗可以好转,但仍存在危及生命的风险。由于该病毒具有流行性和暴发性,动物与人都具有较高的感染率,感染后会出现蔓延的趋势,容易引起人们恐慌,已成为危害社会安全的公共问题。目前临床上对于猴痘病毒并无特效疗法,且无最佳控制感染的方法,因此对该病毒进行准确、快速的诊断具有重要的意义,有利于人畜共患病的筛查,为该病毒的防控提供先决条件。本研究通过综述猴痘病毒的流行病学趋势,探究该病毒的检测技术进展,为我国应对猴痘病毒的流行提供帮助。

猴痘病毒研究进展

猴痘是一种由猴痘病毒(MPXV)引起的症状和体征类似天花的人兽共患传染病。MPXV于1958年在实验室中的动物身上首次被发现,1970年在刚果民主共和国发现了第1例人感染MPXV,过去主要流行于中非和西非,但传染性和致病力均较弱。2022年以来,世界多国出现猴痘疫情,并呈现快速扩散态势。2022年7月23日,世界卫生组织(WHO)表示,猴痘疫情在70多个国家的蔓延是一种“非同寻常”的情况,将其列为全球紧急状态事件。论文围绕MPXV病原学(包括基因组特征、病毒复制、致病机理、分离培养和理化特性)、流行病学、致病性及实验室诊断方法等方面进行综述,以期为该病的科学预防和控制提供借鉴。

江苏省23例猴痘病例病毒基因组特征分析

目的分析2023年6月至9月江苏省23例猴痘病例病毒全基因组序列并研究其分子进化特征。方法收集猴痘病例口咽拭子、痘疱液、痘疱渗出物拭子等样本,以实时定量PCR进行病毒核酸检测,利用扩增子测序技术捕获猴痘样本中病毒全基因组,通过MiniSeq高通量测序仪进行二代测序,对序列进行病毒进化和变异分析。结果23份样本的平均测序深度907.30×~11578.58×,基因组覆盖度(测序深度≥10×)95.50%~99.94%。系统发育分析显示,病毒均属于MPXVⅡb C.1(2023)谱系,与来自同时期日本、韩国、葡萄牙和中国的序列同属一个分支,并分布于3个聚类簇中。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)分析共发现60个SNPs,包含59处碱基替换和1处碱基缺失,其中非同义突变26个,分别影响宿主免疫调控、膜蛋白和病毒转录调控功能。26个非同义突变中有25个SNPs为载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样(APOBEC3-like)突变,且23份样本中的6个共享突变均为APOBEC3-like突变。样本23010与23011只有C177833T一个突变位点的区别,且C76450T和G80405A位点均只在这两个样本中出现。结论江苏省2023年6月至9月23例猴痘病毒均为Ⅱb进化分支C.1(2023)谱系,病毒来源为多个源头输入,应持续开展猴痘病毒全基因组监测和研究,密切关注病毒来源和在本地传播后的变异进化方式。

猴痘病毒进化及检测技术研究进展

猴痘病毒是与天花病毒近亲的一种正痘病毒。2022年,猴痘病毒在全球100多个国家引起暴发和流行,成为年度国际关注的突发公共卫生事件。与之前的暴发疫情相比,引发2022年疫情的猴痘病毒明显增强了对人体的适应性,传播范围持续扩大,导致全球大流行的风险增加。现对猴痘病毒分子进化及实验室检测技术的最新进展进行综述,并对猴痘病毒未来的研究方向和防控策略提出思考和建议。

猴痘病毒的感染与猴痘的动物模型

猴痘是猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)感染引起的传染性疾病。猴痘病毒的宿主依然没有完全明确,啮齿类与非人灵长类动物被认为是潜在的宿主。猴痘正在全世界范围内逐渐扩散,但我国一直以来并未开展猴痘的动物模型的研究。作为一种严重危害人类健康的病原体,猴痘病毒有多种感染类型;其在人群中的传播呈现新的特点。因此本文论述了猴痘病毒发现的经过与早期疫情、不同的感染类型和共感染。此外,本文还介绍了啮齿类和非人灵长类动物的实验性感染与猴痘动物模型。

北京地区实验动物中猴痘病毒感染情况调查

目的对北京地区实验动物中猴痘病毒(MPXV)感染情况进行调查。方法参照世界卫生组织(WHO)MPXV实验室检测指导意见,采用荧光PCR法检测北京地区实验动物中MPXV,共642只动物,包括猴127只、小鼠215只、大鼠80只、豚鼠40只、地鼠10只、兔85只、犬85只。其中猴采集咽拭子,大小鼠、豚鼠和地鼠等采集盲肠,兔和犬采集肛拭子,采集的样本加入适量灭菌PBS,盲肠样本充分匀浆,拭子样本涡旋振荡1 min,-70℃反复冻融3次,离心取上清提取核酸,荧光PCR检测MPXV DNA,最后对结果进行分析。结果经荧光PCR检测,127只猴、215只小鼠、80只大鼠、40只豚鼠、10只地鼠、85只兔、85只犬MPXV DNA均为阴性。结论目前未在北京地区实验动物中发现MPXV感染。

猴痘病毒动物宿主的研究进展

猴痘是由猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)引起的人兽共患病.最近,猴痘在非洲以外的多个国家人群中流行,成为全球重要的公共卫生事件.为了了解MPXV的可能宿主来源和传播途径,综述了MPXV在动物中的流行情况及动物对MPXV易感性研究进展,对MPXV“动物—人”相互传播的危险性进行了讨论,为人类及动物防疫部门共同制定有效措施,预防控制猴痘的流行提供参考.

猴痘病毒CrmB蛋白的结构特征及其抗原表位分析

为深入了解猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)的CrmB(cytokine response modifier B)蛋白的结构特征和抗原表位,运用ORF Finder、ExPaSy、SignalP 6.0、TMHMM 2.0、Cell-Ploc、Conserved Domains、SOPMA、SWISS-MODEL、NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1、IEDB、SYFPEITHI、Clustalx、MEGA 11.0、Prankweb、DrugBank等多种生物信息学方法,分析CrmB蛋白的开放阅读框、理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、结构域、糖基化/磷酸化位点、二级/三级结构、B/T细胞抗原表位、抗原决定簇、蛋白同源性、配体结合位点、小分子抑制药物等。CrmB蛋白是由349个氨基酸组成的不稳定蛋白质,相对分子量为38308.75;理论等电点为6.24,分子式为C1621H2550N460O550 S32;二级结构以不规则卷曲为主,有信号肽;具有6个糖基化位点和54个磷酸化位点,15个抗原决定簇,8个B细胞优势抗原表位,8个CLT细胞优势表位,13个Th细胞优势表位,与天花病毒同源性较高。此外,还预测存在5个可能的配体结合区域和2个潜在的小分子抑制药物。为阐明猴痘病毒和宿主细胞相互作用的分子机制以及抗病毒药物和疫苗研发提供参考。

猴痘病毒A23R蛋白的表达、纯化及其小鼠抗血清制备

目的 大肠杆菌细胞表达和镍柱纯化猴痘病毒(MPXV)A23R蛋白,制备小鼠抗MPXV A23R的高效价抗血清。方法构建重组质粒pET-28a-MPXV-A23R,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,优化蛋白表达条件后获得大量蛋白。镍柱纯化重组蛋白A23R并进行Western blot法鉴定。纯化后的A23R蛋白免疫小鼠,制备A23R多克隆抗体,采用ELISA检测抗体免疫滴度。结果 在0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度37℃、诱导20 h时,获得的A23R重组蛋白表达量最大,纯化后的蛋白纯度约为96.07%,经Western blot法鉴定为目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠,第6周时IgG抗体的效价达到1∶102 400。结论 成功获得高表达和高纯度的重组A23R蛋白,并制备了小鼠抗MPXV-A23R的高效价血清。