猴D型反转录病毒Ⅰ型抗体免疫梳检测方法的建立及应用

为建立猴D型反转录病毒Ⅰ型抗体（SRVl）的快速检测方法，本试验采用基因工程技术制备SRV1的SRV1—30基因原核表达产物重组SRV1—30蛋白作为抗原诊断试剂，建立免疫梳方法用于特异性检测实验猴血清中抗SRV1的抗体IgG。结果显示，最佳抗原包被量为100mg／L；制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴SRV1病毒阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应，表明该检测方法特异性强；敏感性分析结果表明，SRV130蛋白能够敏感地检测到1：200倍稀释的SRVl阳性血清；稳定性和重复性试验结果表明，同一样品重复检测3次，变异系数（CV）均小于10％；利用该检测方法在对12份可疑猴血清样品进行检测，免疫梳方法与ELISA检测结果一致率为100．0％，Kappa-1.000。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，具有良好的实用性。

应用反转录聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒（ ＮＤＶ） 和鸽Ⅰ型副粘病毒Ｆ 基因的保守序列，设计合成１ 对引物ＸＺ９ 、ＸＺ１０ ，用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 对３ 株鸽Ⅰ型副粘病毒和６ 种其它禽病原体进行检测。结果，该引物对３ 株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ 产物，而对鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性；ＲＴＰＣＲ 最低能检出１ ｐｇ 的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板。

用猴艾滋病D型逆转录病毒筛选抗艾滋病药物实验模型的建立及应用

以药物对合胞体形成的抑制和对细胞的毒性作为检测指标，应用猴艾滋病D型逆转录病毒（SRV）／Raji细胞系统建立了体外筛选抗艾滋病药物的实验模型。AZT和天花粉蛋白可显著地抑制SRV诱导的合胞体形成，它们的选择指数（SI）分别为数13500和8812。用该模型筛选了46种来源于天然资源的化合物，结果表明有11种天然化合物有明显的抗病毒活性。

猴D型逆转录病毒的研究进展

猴D型逆转录病毒（simiantype-Dretrovirus，SRV），是猴获得性免疫缺陷综合征（Simian acquired immunodeficiency syndrome，SAIDS）即猴艾滋病的主要病原体之一。

猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立

目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。

猴D型逆转录病毒P27基因的表达、纯化及重组蛋白的鉴定

根据GenBank上已发表的猴D型逆转录病毒SRV-2株基因组序列设计合成了一对特异性引物,通过PCR扩增出P27基因。将扩增出的片段克隆到原核表达载体pBAD/Thio-TOPO上,通过序列分析证实该片段与猴D型逆转录病毒SRV-2株P27基因序列一致。将阳性重组质粒转化至大肠杆菌T0P010中,用阿拉伯糖诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和WesternBlot分析,并用proBondTM柱在天然状态下进行纯化。结果表明,表达的融合蛋白分子量约为50KDa,其大小与预期相符。

中国猕猴D型逆转录病毒(SRV)感染猴体的病理学改变

1990年3月,我们用从中国猕猴分离到的猴D型逆转录病毒(SRV)感染3只幼龄恒河猴(90101、90102、90103),接种后23～60d,3只感染猴出现全身淋巴结病、脾脏肿大、中性白细胞减少症等。其中1只实验猴(901O3)在接种后354～489d,间断出现抽搐、强直及四肢痉挛等神经系统症状。经678d观察后处死,3只实验猴淋巴网状内皮组织显微镜下观察显示典型的猴艾滋病(SAIDS)病理改变;1只实验猴(90103)还显示有大脑脱髓鞘、噬神经细胞现象和神经细胞缩裂死亡等病理改变。

国内部分地区猴场猴D型逆转录病毒血清学调查

为了解国内不同地区猴场猴D型逆转录病毒(simian type D retrovirus,SRV)感染情况,采集广东、云南、海南、广西、河南境内主要猴场的实验猴血清752份,通过ELISA法检测SRV抗体,评估不同猴场感染情况。结果显示:受检样本总阳性率为5.19%,繁殖单元阳性率为16.15%。不同地区猴场实验猴群的感染率存在一定差异,其中云南实验猴感染率最高,样本和繁殖单元阳性率分别为13.50%和46.15%;其次是海南猴场实验猴,样本和繁殖单元阳性率分别为5.00%和17.65%;广东省两家猴场的感染率较低,样本阳性率分别为2.50%和1.00%,繁殖单元阳性率分别为12.90%和5.00%;广西与河南猴场未检出SRV阳性。不同猴种的感染率有明显差异(P<0.05),恒河猴样本和繁殖单元阳性率分别为11.64%和35.29%,而食蟹猴分别为2.31%和9.38%。结果表明,SRV在国内人工饲养猴群中感染较普遍,部分地区感染较为严重,尤其是恒河猴,应采取措施加强对猴场SRV流行的控制。

猴D型逆转录病毒p27基因的克隆表达及诊断价值评价

目的 克隆表达猴D型逆转录病毒（SRV） p27基因,评价其诊断价值.方法 PCR扩增p27基因片段,定向克隆至原核表达载体pET-28b（＋）,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta （DE3）中诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,目的蛋白经镍柱亲和层析纯化后用ELISA方法评价其诊断价值.结果 重组质粒转化宿主菌后在37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓-度为0.5 mmol/L的条件下诱导4h,可溶性p27蛋白表达量最大,且具有免疫学活性.纯化后测定融合蛋白浓度为2.043 g/L,纯度93.3％,以融合蛋白为诊断抗原包被ELISA板检测3份标准阳性血清和22份阴性血清,检出率为100％.结论 p27基因成功表达并具有良好的反应原性,可作为猴D型逆转录病毒血清学检测的候选抗原.

RT-PCR-RFLP方法鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒

建立一种可检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的RT-PCR-RFLP方法。通过对JEV基因Ⅰ型(GⅠ)和基因Ⅲ型(GⅢ)核酸序列的比对分析,设计1对特异性引物对JEV C-PrM-E区域部分基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶SpeⅠ消化后于15g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并利用建立的RT-PCR-RFLP方法对78份临床样品进行了JEV的检测及基因型鉴定。结果显示,特异性引物可扩增出长为819bp的片段,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性。经SpeⅠ酶切,基因Ⅰ型JEV RT-PCR产物被切为568和251bp 2个条带,基因Ⅲ型JEV RT-PCR产物被切为446、251和122bp 3个条带,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV混合RT-PCR产物被切为568、446、251和122bp 4个条带,该方法最低可检出1.5pg·μL-1的JEV RNA。RT-PCR-RFLP结果显示78份临床样品中有14份为JEV阳性,其中6份为基因Ⅰ型,8份为基因Ⅲ型,与核苷酸测序分析结果一致。本研究为日本脑炎病毒的实验室诊断及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别提供了一种快速有效的分子生物学方法。

鸽I型副粘病毒的RT-PCR套式PCR检测方法的建立

对 3个中国广东的鸽I型副粘病毒分离株 (P4、P5和P7)基因组RNA以反转录 聚合酶链反应法 (RT_PCR)扩增了F基因 75 %的基因区域 ( 3 4 3～ 1673nt)。其中毒株P4和P7准确扩增出预期大小明亮的DNA片段 ,而P5扩增出片段很淡 ,用该RT_PCR产物作模板以相同引物再作PCR ,结果可以扩增出大小与预期一致的明亮条带。此方法可快速检测鸽I型副粘病毒(PPMV_1)。

上海地区猴免疫缺陷病毒和猴D型逆转录病毒感染的血清学调查

为了解上海地区实验用猴感染猴免疫缺陷病毒（SIV）和猴D型逆转录病毒（SRV）的情况,用间接ELISA方法对2012—2015年上海各实验用猴生产单位送检的475份猴血清进行了检测。结果显示SIV抗体阳性血清20份,阳性率4.21%;SRV抗体阳性血清1份,阳性率0.21%,阳性率与送检年份和无相关性。本研究为上海地区实验用猴SIV和SRV的预防提供参考依据。

巢式PCR检测食蟹猴和猕猴中SRV和SFV

目的利用巢式PCR方法检测圈养的食蟹猴(Macaca fascicularis)和猕猴(Macaca mulatta)中猴D型逆转录病毒(Simian Type D Retrovirus SRV)和猴泡沫病毒(Simian foamy virus SFV)。方法针对SRV-env和SFV-pol基因的保守区序列设计特异性外引物,然后再设计特异性内引物。将外引物扩增出的片段克隆到PJET1.2blunt载体中作为阳性对照,运用NCBI中BLAST软件比对测序结果。用巢式PCR方法分别检测食蟹猴和猕猴中SRV和SFV。结果发现食蟹猴中SFV感染率为65.2%,SRV感染率为9.5%,猕猴中SFV感染率为60.5%,SRV感染率为12.8%。结论圈养的食蟹猴和猕猴SFV的感染率均较高,SRV感染率很低。

基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒RT-LAMP鉴别检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、特异的鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的反转录-环介导等温扩增方法,根据Gen Bank中登录的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV毒株基因序列,分别设计了1套基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物,并以此引物分别建立了基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法。结果显示,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法均能在1 h内完成对相应基因型JEV RNA的扩增,并与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒和伪狂犬病病毒无交叉反应。灵敏性试验结果显示,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特异性RT-LAMP方法均能扩增出24 copies的JEV RNA。本研究建立的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特异性RT-LAMP检测方法具有灵敏性高、特异性好、简便、快速的特点,能够快速对JEV进行检测及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别,具有广泛的应用价值。

HIV-1非核苷类反转录酶抑制剂耐药相关突变及其复制适应性研究

非核苷类反转录酶抑制剂是高效抗反转录病毒疗法(HAART)治疗艾滋病的重要组成部分。文章综述了非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)的耐药相关突变位点,如主要耐药突变位点、罕见的耐药突变位点、非多态性附属耐药突变位点及突变位点的相互作用;并分别阐述了各个主要耐药突变位点对病毒复制适应性的影响。对今后HIV-1NNRTIs耐药相关工作进行了展望。

2021年湖州市新确证HIV-1感染者分子亚型及耐药分析

目的 了解2021年湖州市新确证HIV-1感染者分子亚型分布情况及治疗前耐药水平,为后续的抗逆转录病毒治疗提供依据。方法 采集2021年湖州市新确诊并且未经过抗病毒治疗的HIV-1感染者血浆,提取标本RNA,对pol区基因进行扩增并测序,应用软件及耐药数据库对获得序列进行分子分型及耐药情况分析。结果 共获得196条pol区序列,共分析得到9种HIV-1亚型或流行重组型,优势亚型为CRF07_BC (58.67%)、CRF01_AE (26.2%)、CRF08_BC (9.18%)、其他亚型或流行重组型(6.12%)。通过HIVdb Program工具比对后共有22例感染者存在低度及以上耐药,其中2例、1例、19例分别对PIs、NRTIs、NNRTIs存在耐药;1例同时对PIs、NNRTIs耐药。NNRTIs耐药突变中V179T/D/E突变最为多见,其次是E138A/K和K103N;NRTIs耐药突变只检出L210W;PIs耐药突变为M46L/I、L90M、I47V。结论 湖州市2021年整体治疗前耐药率已经超过10%,PIs与NRTIs耐药风险相对较低,但对NNRTIs耐药结果并不理想。应加强耐药监测,有效减少耐药株在湖州地区的传播。

温州市新报告HIV-1感染者治疗前耐药分析

目的了解温州市2019年新报告艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者治疗前耐药(PDR)情况,为指导艾滋病抗病毒治疗提供依据。方法选择温州市2019年新报告的232例尚未经抗反转录病毒治疗(ART)的HIV-1感染者为研究对象,采集血浆样本,提取HIV-1病毒RNA,采用反转录PCR和巢式PCR扩增pol区基因并测序,分析耐药突变位点及对非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)、核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)的耐药情况。结果获得199例未经ART治疗的HIV-1感染者的pol区基因序列,共检出8种基因亚型,以CRF07BC和CRF01AE为主,分别为94例和58例,占47.24%和29.15%;检出2种独特重组型毒株(URFs),分别为URF (CRF01AE/BC)和URF (B/C)。PDR 16例,检出率为8.04%。耐药位点突变31例,占15.58%;其中针对NNRTIs、NRTIs和PIs耐药突变位点分别检出20例、2例和9例,占64.52%、6.45%和29.03%。NNRTIs耐药位点突变包括K101E、K103N/R、V106I、E138K、V179D/E/T、Y181C、G190A和H221Y,4例病例同时出现2个耐药位点突变;NRTIs耐药位点突变为V75M和M184V;PIs耐药位点突变为M46I、L33F和Q58E。对我国新上市的NNRTIs新药多拉韦林(DOR)检出2例耐药病例。结论温州市2019年新报告HIV-1感染者PDR检出率为8.04%,以NNRTIs耐药为主;已出现对新药DOR的耐药,应加强耐药监测。

常用PCR技术及其在禽病研究中的应用

聚合酶链式反应技术（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是１９８５年美国Ｃｅｔｕｓ公司Ｍｕｌｉｓ等人开发的一项专利，特点是所需样品极少，获得结果相当准确，因而用途越来越广泛。一ＰＣＲ基本原理类似于天然ＤＮＡ的复制机制根据已知的待...