超高效液相色谱-串联质谱法测定玉米油中玉米赤酶烯酮的残留量

目的建立玉米油中玉米赤酶烯酮检测的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。方法样品经乙腈超声提取,经免疫亲和柱进行净化,采用Waters ACQITY BEH（2.1 mm×100 mm,1.7μm）色谱柱分离,以0.1%氨水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱;质谱以负离子模式扫描和多反应监测（MRM）模式进行检测,以内标法定量。结果玉米赤酶烯酮在2~100μg/L浓度范围内呈良好的线性关系,在5、20、80μg/kg 3个添加水平下,加标回收率为90.2%~105.1%,相对标准偏差为1.66%~3.50%。玉米赤霉烯酮的检出限为1.0μg/kg,定量限为3.0μg/kg。结论本方法灵敏、结果准确可靠,可适用于玉米油中玉米赤酶烯酮的检测。

聚多巴胺磁性分子印迹聚合物的制备及其在测定食品中玉米赤酶烯酮上的应用

采用表面分子印迹技术,以四氧化三铁纳米粒子(Fe_(3)O_(4)NPs)为磁核,槲皮素为模拟模板分子,多巴胺(DA)为功能单体和交联剂,一步法制备了Fe_(3)O_(4)磁性分子印迹聚合物(Fe_(3)O_(4)@PDA MIPs)。采用透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱仪对该磁性分子印迹聚合物进行了表征,并采用等温吸附曲线考察了其对玉米赤酶烯酮的吸附性能。结果显示,该磁性分子印迹聚合物对玉米赤酶烯酮的吸附方式符合Langmuir模型,且最大吸附容量为1.49 mg·g^(-1)。以Fe_(3)O_(4)@PDA MIPs为分散固相萃取剂,优化了Fe_(3)O_(4)@PDA MIPs用量、溶液酸度、超声萃取时间、解吸溶剂种类和解吸方式等萃取参数,并结合高效液相色谱-荧光检测法测定食品中玉米赤酶烯酮的含量。优化的试验条件如下:用体积比为9∶1的乙腈-水的混合液100 mL对已粉粹混匀的40.0 g样品超声提取30 min,过滤,分取20 mL提取液于顶空瓶中,氮气吹至近干,再分别加入30 mg Fe_(3)O_(4)@PDA MIPs和10 mL水,超声萃取5 min,采用2 mL乙腈解吸2次(每次1 mL)的方式进行解吸,分取0.5 mL解吸液于1.5 mL进样瓶中,加入0.5 mL水,供高效液相色谱法测定。结果表明,玉米赤酶烯酮的质量浓度在1~20μg·L^(-1)内与对应的峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)为0.68μg·L^(-1)。按照标准加入法进行回收试验,回收率为80.1%~101%,测定值的相对标准偏差(n=5)为5.0%~8.6%。此外,该磁性分子印迹聚合物具有良好的稳定性,至少可重复使用7次。

玉米赤酶烯酮降解酶优化表达的应用

为提高ZEN降解酶的表达量,通过利用PCR法从具有玉米赤酶烯酮降解酶序列的载体中扩增玉米赤酶烯酮降解酶基因的手段,构建黑曲霉表达载体pSZHG-ZEN和带有黑曲霉内源高表达融合蛋白阿魏酸酯酶faeA基因的载体pSZHG-faeA-ZEN。结果表明:酶活检测结果显示载体pSZHG-ZEN以及pSZHG-faz分泌表达的最高发酵酶活为383.77U·mL^(-1)和1 378.33U·mL^(-1),表明构建的融合蛋白表达载体具有更高的活力。

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定粮谷中的玉米赤酶烯酮

建立了快速检测粮谷中玉米赤酶烯酮的高效液相色谱–串联质谱方法。样品经甲酸化乙腈提取,Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化,以高效液相色谱–串联质谱法对粮谷中的玉米赤酶烯酮进行测定。玉米赤酶烯酮的检出限为1.0μg/kg,线性范围为3～200μg/kg,测定结果的相对标准偏差为3.1%(n=6),样品加标回收率为84.8%～94.7%。该方法具有较高的选择性、灵敏度和准确度,能够满足粮谷中痕量玉米赤酶烯酮的分析要求。

高效液相色谱-二极管阵列检测器同时测定中药中玉米赤酶烯酮和α-玉米赤霉烯醇

目的:建立同时测定不同中药中真菌毒素玉米赤酶烯酮(ZON)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)的高效液相色谱法,并采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)对阳性结果进行确证。方法:样品经甲醇-水溶液(80:20,v/v)提取,免疫亲和柱净化,C18分析色谱柱分离,以水-乙腈(50:50,v/v)为流动相,检测波长236nm,测定结果采用HPLC-ESI-MS/MS进行确证。结果:在0.02-2.50μg/mL范围内,ZON和α-ZOL的线性相关系数均为0.9998。通过添加回收试验,ZON 3个添加水平的回收率为83.8%-98.1%,相对标准偏差为0.9%-7.3%;α-ZOL 3个添加水平的回收率为88.4%-95.5%,相对标准偏差为1.9%-6.2%。ZON和α-ZOL的定量限(S/N=10)分别为18μg/kg和15μg/kg。结论:该方法简便,准确,适用于中药中微量真菌毒素ZON和α-ZOL的检测。

高效液相色谱-串联质谱法同时测定中药中的玉米赤酶烯酮和α-玉米赤霉烯醇

目的：建立同时测定中药中真菌毒素玉米赤酶烯酮（ZON）和α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）的高效液相色谱-串联质谱法,对市售中药材及其制品中的ZON和α-ZOL进行检测。方法：样品经甲醇-水溶液（80∶20,v/v）提取,免疫亲和柱净化,C18分析色谱柱分离,以0.1%（v/v）甲酸-水/0.1%（v/v）甲酸-乙腈为流动相,采用梯度洗脱方式进行液相色谱分离,多反应监测模式,以染料木素为内标进行定量。结果：在0.1 ng.m l-1~500 ng.m l-1范围内,ZON和α-ZOL的线性相关系数分别为0.9981和0.9988。通过添加回收试验,两种毒素的定量限（S/N=10）均为0.12μg.kg-1,ZON三个添加水平的回收率为74.4%~96.5%,相对标准偏差为1.7%~5.0%;α-ZOL三个添加水平的回收率为89.3%~98.3%,相对标准偏差为1.5%~8.1%。结论：该方法简单快速、灵敏度和选择性高,适用于中药中微量真菌毒素ZON和α-ZOL的检测。

高效液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法测定玉米油中玉米赤酶烯酮的比较

目的比较高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)2种方法测定玉米油中玉米赤酶烯酮的优点、缺点。方法分别以HPLC和UPLC-MS/MS进行测定,考察2种方法测定结果的相关性,比较2种方法的性能指标。结果 2种方法的定量结果差异无统计学意义(P>0.05),具有良好的相关性;采用高效液相色谱法时,对于检出限≥5.0μg/kg的样品,2种方法的检出率基本相符;对于检出限<5.0μg/kg的样品,由于UPLC-MS/MS具有更高的灵敏度,该方法的检出率高于HPLC。结论 2种方法均能应用于玉米油中玉米赤酶烯酮的测定。高效液相色谱法因具有准确、实用和配置成本相对低的优点,更适合推广,可用于玉米油中玉米赤酶烯酮的常规监测;超高效液相色谱-串联质谱法的灵敏度高,但配置成本高,更适用于确认验证。

玉米赤霉烯酮、呕吐毒素及黄曲霉毒素B1联合作用对小鼠肝脏的影响

试验旨在探讨玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素B1(AFB1)3种霉菌毒素联合作用对小鼠肝脏的影响。选用48只8周龄雄性ICR小鼠,随机分为4组,每组12个重复,适应性饲喂10d后,以玉米油作为溶剂进行腹腔注射,分别为溶剂对照组(CON组,腹腔注射等量玉米油)、低剂量霉菌毒素联合作用组(LD组,10 mg/kg bw ZEN+1 mg/kg bw DON+0.5 mg/kg bw AFB1)、中剂量霉菌毒素联合作用组(MD组,20 mg/kg bw ZEN+1.5 mg/kg bw DON+1 mg/kg bw AFB1);高剂量霉菌毒素联合作用组(HD组,30 mg/kg bw ZEN+2 mg/kg bw DON+2 mg/kg bw AFB1)。处理结束24 h后处死小鼠并收集样本。结果表明:与CON组相比,LD组、MD组及HD组的白细胞数量显著降低,LD组的血小板数量显著升高;与CON组相比,LD组、MD组、HD组的血浆谷丙转氨酶(ALT)水平均显著升高,MD组的肝组织碱性磷酸酶(ALP)水平显著升高。LD组、MD组和HD组肝脏组织出现肝细胞肿大和炎性细胞浸润。与CON组相比,LD组IL-6显著性升高;MD、HD组IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高。综上所述,霉菌毒素联合作用使肝脏中促炎因子过量表达,造成肝脏组织炎性细胞浸润和肝细胞肿胀,损伤肝脏功能。

玉米赤酶烯酮对大鼠子宫雌激素受体影响的探讨

目的探讨玉米赤霉烯酮对子宫雌激素受体的影响及其雌激素样作用机制。方法 30只大鼠行双侧去卵巢手术后随机分为阴性对照组(蒸馏水)、低,中、高剂量玉米赤霉烯酮组(0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.20mg/kg)和阳性对照组(0.08mkg雌二醇),连续用药3d后取子宫,采用放射性配基结合分析法和雌激素受体结合试验检测雌激素受体数量。结果玉米赤霉烯酮各浓度组放射活性与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P≤0.05)。玉米赤霉烯酮各浓度组雌激素受体数量与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P≥0.05)。结论玉米赤霉烯酮可能是通过影响雌二醇与雌激素受体结合和雌激素受体的数量显示雌激素样作用。

Bond Elut Mycotoxin固相萃取柱与免疫亲合柱在玉米油中玉米赤酶烯酮残留量液相色谱测定样品前处理中的性能比较

目的比较Bond Elut Mycotoxin固相萃取与免疫亲合净化方法在高效液相色谱法测定玉米油中玉米赤酶烯酮残留量的优点与缺点。方法分别以Bond Elut Mycotoxin固相萃取与免疫亲合净化进行玉米油样品的处理,用高效液相色谱法(HPLC)测定玉米赤酶烯酮残留量,考察2种方法测定结果的相关性,比较2种方法的性能指标。结果 2种方法的定量结果差异无统计学意义(P>0.05);采用固相萃取净化法时,对于检出限≥8.0μg/kg的样品,2种方法的检出率基本相符;对于检出限<8.0μg/kg的样品,由于免疫亲合净化法进行了浓缩,其检出率高于固相萃取净化法。结论 2种方法均能应用于玉米油中玉米赤酶烯酮的测定。免疫亲合柱样前处理方法其处理过程繁杂,耗时,容易引入污染。而Bond Elut Mycotoxin固相萃取净化柱样品前处理方法简便,节约时间,提高通量,保质期长,更适用于大量样品的测定。

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表达及其降解毒素初步研究

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌属产生的次生代谢物,是极易污染粮食作物的真菌毒素之一。ZEN具有强烈的雌激素样效应及致癌性,给人类和动物的健康造成巨大威胁。本研究在NCBI数据库中进行同源比对,获得了一些ZHD101降解酶的同源基因,其中,1个来源于真菌——杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)的蛋白序列与ZHD101具有32%的同源性,基因大小为861 bp。通过化学合成方法得到该全长基因,通过构建E.coli原核表达系统进行蛋白表达,蛋白经亲和色谱纯化后对ZEN分子进行降解活性验证,HPLC结果表明,该蛋白在6 h内对10μg ZEN分子的降解率为98%,酶活为200 U/m L,从而获得了1个新的ZEN降解酶基因。

玉米赤霉烯酮降解酶在马克斯克鲁维酵母中的表达及高产菌株的诱变筛选

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是镰刀菌属霉菌产生的一种霉菌毒素,常见于霉变的玉米、小麦等谷物中.研究发现,来源于粉红黏帚霉(Gliocladium roseum)的α/β水解酶ZHD101能够断裂ZEN的内酯键,破坏ZEN的毒性.本文利用食品安全级的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)重组分泌表达了ZHD101,发酵液上清中的表达产物具有水解ZEN的活性.利用UV和^(60)Co-γ联合诱变方法,提高了ZHD101在马克斯克鲁维酵母中的表达水平.高效液相色谱(HPLC)分析表明,重组菌株分泌表达的ZHD101酶蛋白既能水解标准品ZEN,又能在较温和的条件下水解发霉玉米样本中的ZEN,结果表明该重组菌株表达的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101,可应用于发霉玉米的脱毒处理.

养猪生产:不得不防霉玉米中毒

在目前养猪生产中，许多养猪场(户)都普遍反映今年的猪难养、病难治，通过现场了解和对饲料的化验发现喂猪所用的玉米存在不同程度的霉变。

PERK在玉米赤霉烯酮诱导TM4细胞凋亡中的作用

以TM4细胞（小鼠睾丸支持细胞株）为材料，用不同浓度的玉米赤酶烯酮（zearalenone，ZEA）染毒，利用透射电子显微镜（设0，5，10，20μmol／LZEA浓度组），流式细胞仪、Western blot等技术检测了细胞超微结构、凋亡率、凋亡相关调控蛋白以及内质网应激相关蛋白的变化（设0，0．1，1，10，20μmol／L ZEA浓度组）；通过转染PERK（蛋白激酶R样内质网激酶）siRNA，沉默PERK基因后检测了ZEA诱导TM4细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的变化。结果显示：与对照组相比，20μmol／L浓度组损伤最为严重。随着ZEA浓度的增加，细胞凋亡相关蛋白Bax／Bcl-2的值逐渐升高，cleaved caspase 9、cleaved canpase 3蛋白表达量均呈升高趋势，1μmol／L以上染毒组均较各自对照组有极显著差异（P〈0．01）；内质网应激相关蛋白BIP、CHOP的表达量也呈升高趋势，10gmol／L以上染毒组BIP、0．1μmol／L以上染毒组CHOP的表达量均较对照组有显著或极显著差异（P〈0．05或P〈0．01）；PERK通路蛋白含量在10〉mol／L时最高，20，30〉mol／L时逐渐降低，但各染毒组与对照组相比呈显著或极显著差异（P〈0．05或P〈0．01）；TM4细胞caspase3的活性和凋亡率均呈升高趋势，10μmol／L以上染毒组caspase3的活性较对照组均有极显著差异（P〈0．01），各染毒组细胞的凋亡率较对照组均有极显著差异（P〈0．01）。与10μmol／L ZEA处理组相比，siRNA PERK＋10μmol／L ZEA组细胞凋亡率呈显著下降（P〈0．01），Bax／Bcl-2比值、cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表达量均下降（P〈0．05或P〈0．01）。结果表明，ZEA可触发TM4细胞内质网应激，通过PERK-eLF2α-ATF4信号通路诱导细胞发生凋亡，PERK信号通路在ZEA诱导TM4细胞凋亡中发挥重要作用。

玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5。方法将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化。间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性。结果共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度最高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好。结论已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在"内影像"关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术。

真菌毒素降解酶在大肠杆菌中的表达及活性分析

为了使一种真菌毒素降解酶能够同时高效降解玉米赤霉烯酮(Zearaleonoe,ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)两种真菌毒素,将改造过的基因pETDuet-1-101(玉米赤霉烯酮降解酶基因)-201(脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因)导入BL21受体细胞,使基因pETDuet-1-101-201能够在Trans5α受体细胞中克隆、在BL21受体细胞中表达,构建共表达质粒1个及表达菌株1株。PCR扩增获得目的片段并连入pETDuet-1载体质粒,转化Trans5α富集菌株,经菌落PCR验证阳性片段,培养正确菌株,再转化BL21表达型感受态,培养菌株经IPTG诱导。结果表明:DON的降解率为51.6%,ZEN的降解率为26.7%,证明菌株的蛋白表达对ZEN和DON毒素都有较好的降解能力。

真菌毒素玉米赤霉烯酮生物降解的研究进展

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)及衍生物是一类主要由镰刀菌属的真菌产生的非甾体雌激素类真菌毒素,广泛存在于玉米、大麦、小麦和高粱等谷物饲料及其副产品中,严重危害牲畜及人类健康,迫切需要相关的技术对ZEN进行降解脱毒。传统的物理化学方法不能有效去除谷物中的毒素,并会破坏谷物的营养成分,影响食物口感,甚至造成二次污染,因此利用生物工程技术对ZEN及其衍生物进行脱毒是未来解决这一问题的主要方法。文中简要介绍了ZEN及衍生物和降解ZEN的微生物种类、降解特性,然后详细介绍了目前研究的ZEN降解酶种类、解析唯一的蛋白结构及其异源表达和应用情况,以期为通过分子酶工程和发酵工程等生物工程技术降低ZEN降解酶的成本提供指导,从而提高食品安全。

吉林省粮油产品中B类生物毒素的污染状况及暴露评估

为了解吉林省粮油产品中玉米赤酶烯酮、伏马毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染状况及居民膳食暴露水平,采用高效液相色谱-串联质谱法对2020年吉林省主产区的玉米、小麦、水稻、大豆、葵花籽和花生等129份样品中B类生物毒素污染状况进行检测分析,对吉林省粮油产品中的B类生物毒素急/慢性膳食摄入风险进行评估。结果显示,粮油产品中B类生物毒素的污染风险在可接受范围内,慢性膳食摄入风险(%ADI)和急性膳食摄入风险(%ARfD)均低于100%,对成人和儿童均无显著急、慢性摄入风险。本文为粮油产品安全消费、镰刀菌生物毒素监管提供了科学依据。

大肠杆菌细胞裂解系统的构建及其在真菌毒素降解酶表达中的应用

目的:大肠杆菌中分泌表达重组蛋白受限于其分泌效率,为此设计构建大肠杆菌诱导裂解系统以实现胞内重组蛋白的快速高效分泌。方法:利用大肠菌素E7对细胞的裂解能力,构建共表达目标重组蛋白和E7的大肠杆菌细胞裂解系统,使目标重组蛋白在E7表达后得以释放到培养基中。结果:首先以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)为报告基因,在pET28a(+)载体上构建大肠杆菌素E7和红色荧光蛋白两个表达盒,通过对比分析IPTG一步诱导和IPTG-阿拉伯糖分步诱导系统蛋白质的表达效果,发现分步诱导系统能够更高效地表达并释放目标蛋白到培养基。在IPTG-阿拉伯糖分步诱导裂解系统中表达玉米赤霉烯酮降解酶基因,培养基上清液中检测到玉米赤霉烯酮降解酶有较好的表达量和较高的活性,能够在37℃反应30min的条件下降解约5. 8μg玉米赤霉烯酮毒素。结论:利用大肠菌素E7成功构建大肠杆菌细胞裂解系统,并且此系统在快速释放胞内表达外源蛋白方面有适用性。