α-玉米赤霉烯醇单克隆抗体的研制及CiELISA检测方法的建立

为了建立快速、简便、灵敏的检测动物性食品中α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol,α-ZOL)残留的方法,试验利用活性酯法将α-ZOL与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联鉴定后常规免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠。经筛选,获得1株稳定分泌抗α-ZOL单克隆抗体的杂交瘤细胞(1D4),利用1D4获得的抗α-ZOL单克隆抗体建立了检测α-ZOL的间接竞争酶联免疫吸附试验(Ci ELISA)方法。结果表明:该检测方法在1~1 000 ng/m L范围内线性良好,标准曲线方程为y=0.280 2x+0.025 6(R2=0.990 1),半数抑制浓度为76.32 ng/m L。牛奶加标回收试验显示,α-ZOL的回收率在81.29%~117.53%之间,变异系数在4.42%~9.33%之间。试验建立的Ci ELISA检测方法可用于牛奶中α-ZOL残留的定量检测。

液相色谱-串联质谱法测定饲料中玉米赤霉烯醇的研究

玉米赤霉烯醇具有雌激素的作用,可造成家禽和家畜的雌激素水平提高,同时对雄性动物也有一定的影响,在急性中毒的条件下,使动物突然死亡。本文以液相色谱-串联质谱法测定饲料中的玉米赤霉烯醇,经试验:玉米赤霉烯醇在5~500 ng/m L的浓度范围内呈现良好的线性关系,相关系数均≥0.999;检测限能达到10μg/kg,定量限能达到20μg/kg;回收率均在60%~110%范围内;批内、批间相对标准偏差均≤15%。

复合柱净化-超高效液相色谱串联质谱法测定植物油及谷类制品中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇

目的建立C_(18)-Al_2O_3复合填料固相萃取柱净化,同时检测植物油及谷类制品中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的超高效液相色谱串联质谱方法。方法谷类制品先用正己烷-乙酸乙酯(50:50,V/V)提取,然后和植物油一样用乙腈-水(90:10,V/V)萃取玉米赤霉烯酮类真菌毒素,进一步用C_(18)-Al_2O_3固相萃取柱净化,以乙腈-水为流动相梯度洗脱,以C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.6μm)进行色谱分离,电喷雾离子化负离子多反应监测模式检测,^(13)C_(18)-玉米赤霉烯酮为内标定量。结果玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的线性范围为1.0~500 ng/mL,在植物油和谷类制品中的检出限分别为0.3和0.2μg/kg,定量限为1.0和0.5μg/kg。当添加量为1~100μg/kg时,玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的平均回收率分别为93.5%~108.0%和92.0%~105.0%,相对标准偏差分别为3.2%~8.5%和4.6%~7.8%(n=6)。采用该方法对市售的55份样品进行测定,以玉米油中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇含量、检出率最高,最高含量分别为453.1和5.0μg/kg,中位值分别为126.2和2.0μg/kg。结论该方法操作简便快速,净化效果好,灵敏准确,检测成本低,适于植物油和谷类制品中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的快速检测。

高效液相色谱-串联质谱法测定粮油食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮

建立了粮油食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。样品用三氯甲烷提取,经氢氧化钠溶液和二氯甲烷反萃取净化,定量浓缩后采用HPLC-MS/MS测定。两种目标化合物的线性范围为0.2~100 ng/mL,相关系数（r）大于0.99,α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的检出限分别为1.5μg/kg和1.0μg/kg,不同样品基质加标回收率范围为70.6%~98.9%,相对标准偏差（RSD,n=6）不大于10%。该方法具有灵敏度高、重现性好和成本相对较低等特点,适用于粮油食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定。

高效液相色谱-二极管阵列检测器同时测定中药中玉米赤酶烯酮和α-玉米赤霉烯醇

目的:建立同时测定不同中药中真菌毒素玉米赤酶烯酮(ZON)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)的高效液相色谱法,并采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)对阳性结果进行确证。方法:样品经甲醇-水溶液(80:20,v/v)提取,免疫亲和柱净化,C18分析色谱柱分离,以水-乙腈(50:50,v/v)为流动相,检测波长236nm,测定结果采用HPLC-ESI-MS/MS进行确证。结果:在0.02-2.50μg/mL范围内,ZON和α-ZOL的线性相关系数均为0.9998。通过添加回收试验,ZON 3个添加水平的回收率为83.8%-98.1%,相对标准偏差为0.9%-7.3%;α-ZOL 3个添加水平的回收率为88.4%-95.5%,相对标准偏差为1.9%-6.2%。ZON和α-ZOL的定量限(S/N=10)分别为18μg/kg和15μg/kg。结论:该方法简便,准确,适用于中药中微量真菌毒素ZON和α-ZOL的检测。

高效液相色谱-串联质谱法同时测定中药中的玉米赤酶烯酮和α-玉米赤霉烯醇

目的：建立同时测定中药中真菌毒素玉米赤酶烯酮（ZON）和α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）的高效液相色谱-串联质谱法,对市售中药材及其制品中的ZON和α-ZOL进行检测。方法：样品经甲醇-水溶液（80∶20,v/v）提取,免疫亲和柱净化,C18分析色谱柱分离,以0.1%（v/v）甲酸-水/0.1%（v/v）甲酸-乙腈为流动相,采用梯度洗脱方式进行液相色谱分离,多反应监测模式,以染料木素为内标进行定量。结果：在0.1 ng.m l-1~500 ng.m l-1范围内,ZON和α-ZOL的线性相关系数分别为0.9981和0.9988。通过添加回收试验,两种毒素的定量限（S/N=10）均为0.12μg.kg-1,ZON三个添加水平的回收率为74.4%~96.5%,相对标准偏差为1.7%~5.0%;α-ZOL三个添加水平的回收率为89.3%~98.3%,相对标准偏差为1.5%~8.1%。结论：该方法简单快速、灵敏度和选择性高,适用于中药中微量真菌毒素ZON和α-ZOL的检测。

液质联用法测定饲料中玉米赤霉烯醇的方法研究

玉米赤霉烯醇具有雌激素的作用，可使家禽和家畜的雌激素水平提高，同时对雄性动物也有一定的影响，在急性中毒的条件下，使动物突然死亡。本文以液相色谱-串联质谱法测定饲料中的玉米赤霉烯醇，经试验：玉米赤霉烯醇在5～500ng／mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数均≥0．999；检测限能达到10μg／kg，定量限能达到20μg／kg；回收率均在60％～110%范围内；批内、批间相对标准偏差均≤15％。

β-玉米赤霉烯醇单克隆抗体的研制及CiELISA检测方法的建立

为建立一种针对β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)快速准确的检测方法,笔者用活性酯法将β-ZOL与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工完全抗原,纯化鉴定后免疫BALB/c小鼠。经筛选最终获得1株稳定分泌抗β-ZOL抗体的细胞株1F5。利用该抗体建立检测β-ZOL的间接竞争酶联免疫吸附试验(CiELISA)方法。结果显示,β-ZOL的药物抑制标准曲线在浓度为5~500 ng/m L时线性关系良好,标准曲线方程为y=0.406 3x-0.204 2(R^2=0.990 4),IC_(50)为53.19 ng/m L,检测下限(LOD)为6 ng/m L。该单克隆抗体对β-ZOL的抑制率为100%,与α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、β-雌二醇、呕吐毒素、伏马毒素等基本无交叉反应。牛奶样品β-ZOL添加回收试验显示,β-ZOL的回收率为91.24%~110.07%,变异系数为6.17%~8.73%。说明建立的检测β-ZOL的CiELISA方法稳定可靠。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法同时检测鸡蛋中6种玉米赤霉醇类化合物残留量

建立了鸡蛋中6种玉米赤霉醇类化合物(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮)残留量的免疫亲和柱净化-高效液相色谱检测方法。样品酶解后用叔丁基甲醚提取、氢氧化钠反萃取,经免疫亲和柱富集和净化后,采用高效液相色谱-紫外检测器进行测定。色谱柱:Agilent EclipseXDB-C18(150 mm×4.6 mm,3.5μm);流动相:甲醇-乙腈-水(50∶15∶35,v/v/v);流速:1.0 mL/min;检测波长:270nm。结果表明,6种目标物在0.01～0.2 mg/L范围内线性关系良好,相关系数(r)≥0.999 8,检出限(LOD,S/N≥3)为1.0μg/kg,平均回收率为73.2%～95.7%,相对标准偏差小于8%。该方法灵敏度高、重现性好,适用于鸡蛋样品中痕量玉米赤霉醇类药物残留的测定。

超高效液相色谱-三重四级杆质谱串联法测定粮谷中的玉米赤霉烯酮类真菌毒素的研究

建立了粮谷中玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇检测的超高效液相色谱-三重四级杆质谱串联的分析方法。样品经0.1%甲酸水-乙腈溶液提取,经免疫亲和柱净化,以水溶液(含0.1%甲酸)和甲醇(含0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,质谱以负离子模式扫描和多反应监测模式进行检测,以外标法定量。结果表明,玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇在1~100μg/L浓度范围内呈现良好的线性关系,线性相关系数均大于0.994,检出限为0.5~1.0μg/kg,在5、20、80μg/kg 3个添加水平下,平均加标回收率为87.2%~100.6%,相对标准偏差为3.2%~6.4%。本方法结果准确可靠,灵敏度高,可适用于粮谷中玉米赤霉烯酮类真菌毒素的检测。

免疫亲和净化-超高效液相色谱-串联质 谱法测定食品中玉米赤霉烯酮类真菌毒素

当前在玉米赤霉烯酮类的真菌毒素检测中,使用液相色谱和液相色谱-质谱的方法较多,本文则构建了一种针对食品中6种玉米赤霉烯酮类真菌毒素的免疫亲和净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法,包括玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮。本检测方法的前处理工序非常简便,利用免疫亲和柱进行净化及液标法进行定量,能够同时测定6种玉米赤霉烯酮类真菌毒素。除了谷物以外,本检测方法还能应用于肉、蛋、乳等食品的检测。

霉菌毒素OTA和α-ZOL对HepG2细胞增殖及氧化损伤的影响

为了研究不同剂量赭曲霉毒素A(OTA)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)联合作用对Hep G2细胞毒性的交互作用及其可能机制,试验采用3×3析因试验设计,设OTA浓度和α-ZOL浓度2个因素,OTA浓度水平分别为0、6和12μmol/L,α-ZOL浓度水平分别为0、15和30μmol/L,全组合后共组成9个水平组合.毒素作用时间为48h.用边际均数轮廓图判断细胞毒性和氧化损伤的交互作用,结果发现OTA和α-ZOL联合作用时,细胞毒性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量的交互作用一致,均表现为拮抗效应;且细胞活力的变化与SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性和GSH含量的变化表现为显著性相关(P<0.05).结果表明细胞毒性的交互作用为拮抗效应,且氧化损伤是毒素诱发细胞毒性的主要途径之一.

复合柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定粮油中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮类毒素

目的建立C18-Al2O3复合固相萃取柱净化,同时检测粮食及植物油中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮类毒素的超高效液相色谱-串联质谱方法。方法植物油样品用乙腈-水(90∶10,V∶V)提取,粮食样品先用乙腈-乙酸-水(84∶1∶16,V∶V)再用二氯甲烷-乙酸乙酯(90∶10,V∶V)进行二次提取,进一步采用C18-Al2O3复合固相萃取柱净化,稳定同位素内标稀释,以乙腈和水为流动相,CORTECSTMC18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7μm)进行分离,电喷雾离子化多反应监测模式检测。结果黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮类毒素的线性范围分别为0.1~30.0和1.0~500.0ng/ml,检出限分别为0.03和0.3μg/kg,定量限分别为0.10和1.0μg/kg。黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮类毒素的平均回收率分别为68.3%~98.6%和84.5%~108.0%,相对标准偏差分别为4.6%~11.5%和4.2%~9.0%(n=6)。采用本方法分析了国内外5种质控样品,测定值均在质控样品指定范围内。对大连市市售的100份粮油样品进行测定,结果表明散装花生油和玉米油中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮检出率较高,最高含量分别为12.80和370.00μg/kg。结论本方法定量准确、操作简便、更环保、检测成本低,适于批量粮油样品中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮类毒素的同时检测。

玉米赤霉烯酮的类雌激素效应和生物学机制

玉米赤霉烯酮(ZEA)在全球范围内广泛存在于受污染的谷物中,例如玉米和豆粕等。尽管ZEA是非甾体化合物,但是能够活化雌激素受体而引起生殖器官功能性和形态学变化。自然界中的动物以猪最为敏感,临床表现包括卵巢萎缩、发情期间隔变长、黄体持久、生殖力减弱和死胚。对比试验表明这些症状的强度取决于生殖系统状态,在动物性成熟之前症状更加显著。ZEA不仅交互作用于两种类型的雌激素受体,而且可以作用于羟基类固醇脱氢酶,这种酶可以将ZEA转化成两种异构体,即:α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇,并进一步还原产生α-玉米赤霉烯酮和β-玉米赤霉烯酮。ZEA被α-羟基化后,类雌激素作用显著提高,玉米赤霉烯酮在猪体内α-羟基化的比例较高,因此,猪成为对玉米赤霉烯酮最敏感的动物。另一个影响种类特征敏感性可能的因素是导致ZEA糖脂化而失活的能力。与其他动物相比,猪具有较低的糖脂化能力,因此对ZEA中毒反应更为敏感。体内和体外试验表明ZEA及其代谢产物是参与甾类代谢有关的各种酶的底物。因此,鉴于上述玉米赤霉烯酮对雌激素受体的交互作用和酶动力学的调节作用,ZEA被称作是内分泌干扰物。此分类证实,母体摄食ZEA会影响后代(F1代)的发育和生殖能力。生物学多样性似乎也可以解释不同日龄的猪产生不同的临床症状,同时也可表明日粮中的玉米赤霉烯酮所产生的危害不会产生显著的临床症状。

来源于Exophiala aquamarina的新型玉米赤霉烯酮水解酶的性质及底物结合中心关键氨基酸的功能研究

目的:开发一种对α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZOL)催化活性高的水解酶,以促进玉米赤霉烯酮的酶法完全脱毒,推动玉米赤霉烯酮降解酶在饲料业和畜牧业的应用。方法:在NCBI数据库中通过基因挖掘获得一个来源于Exophiala aquamarina CBS 119918的新型玉米赤霉烯酮水解酶EaZHD,基因全长792 bp。构建重组质粒pET46-Eazhd,并在大肠杆菌中成功表达。经NiNTA亲和层析和DEAE阴离子交换柱纯化后,利用HPLC测定残余底物浓度的方法来表征其酶学性质。结果:EaZHD对玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的酶活力为0.764 U/mg,而对α-ZOL的酶活力为1.529 U/mg,是对底物ZEN降解活力的2倍。Ea ZHD在p H 8.6和温度40℃条件下的活性最高,并具有较好的热稳定性和碱性条件下较高的p H稳定性。通过对Ea ZHD活性中心附近的氨基酸进行突变和活性分析,确定了对催化活性起关键作用的三个氨基酸,以及对底物特异性有影响的两个关键氨基酸。结论:为推动饲料业和畜牧业中玉米赤霉烯酮的酶法脱毒奠定了基础。

槲皮素对α-ZOL诱导Caco-2细胞损伤的保护作用研究

为研究槲皮素对α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)诱导细胞损伤的保护作用,通过研究活性氧水平、线粒体膜电位、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、三磷酸腺苷(ATP)含量等变化情况,分析槲皮素对α-ZOL诱导的细胞氧化损伤和线粒体损伤的影响;通过荧光染色和流式细胞术检测研究细胞凋亡情况,并利用蛋白免疫印迹法检测目的蛋白核转录因子E2相关因子2(Nrf2)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的表达。结果表明,模型组人结肠腺癌细胞Caco-2细胞氧化损伤程度随α-ZOL浓度的递增而加剧;与模型组相比,槲皮素可通过降低细胞内活性氧、MDA含量和提高抗氧化酶活力来减少α-ZOL对Caco-2细胞的氧化损伤,并通过提高ATP含量和线粒体膜电位来改善线粒体功能。此外,槲皮素还会上调Nrf2和Bcl-2的表达、下调Caspase-3的表达,从而减少由α-ZOL引起的细胞凋亡。本研究结果对预防和控制α-ZOL的毒性具有积极意义。

高效液相色谱质谱法快速测定小麦中DON、ZON、T-2的残留方法研究

建立了快速检测小麦中DON、ZON、T-2的高效液相色谱质谱方法,针对小麦样品的特点,采用50%乙腈/水溶液提取,提取液经氯化钠盐析,反相色谱分离,高效液相色谱-串联四级杆质谱检测,多反应监测模式采集,外标法定量。该方法一次提取,同时测定小麦中3种毒素,具有快速、准确的特点。

科技

蜜蜂所揭示α-玉米赤霉烯醇及其隐蔽性形式的生物转化规律近日,中国农业科学院蜜蜂研究所蜜粉源植物产地识别与控制团队系统揭示了α-玉米赤霉烯醇及其隐蔽性形式的生物转化规律。该研究成果的发表,不仅填补了α-玉米赤霉烯醇在生物体内代谢途径的空白,更为其毒理学研究与风险评估提供了新的思路和科学依据。相关研究成果在线发表在《有害物质杂志(Journal of Hazardous Materials)》上。

免疫亲和净化-液相色谱-串联质谱测定中成药中14个真菌毒素

目的:建立同时测定中成药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,HT-2毒素,T-2毒素,赭曲霉毒素A,伏马毒素B1、B2,玉米赤霉烯酮,α-玉米赤霉烯醇,β-玉米赤霉烯醇,α-玉米赤霉醇以及β-玉米赤霉醇共14个真菌毒素的测定方法。方法:采用PBS溶液和70%甲醇-PBS溶液依次提取样品中真菌毒素,提取液经多功能免疫亲和柱净化,0.1%吐温-PBS溶液和水依次淋洗,甲醇洗脱,氮气流下浓缩定容,测定时采用Waters Xterra C18MS(100 mm×2.1 mm,3.5μm)分析柱,0.3 mL·min-1的流速,梯度洗脱,质谱测定采用多反应监测(MRM)模式。结果:14个真菌毒素的最小检出浓度(LOQ)为1.0～5.0μg·kg-1;4个中成药基质的3个不同水平的添加回收率(n=6)为75.7%～97.9%,RSD为5.3%～13.8%。结论:本方法采用了多功能免疫亲和柱净化,质谱定性定量,加快了检测速度,降低了中成药复杂基体的干扰,方法检测限满足了国内外中成药多个真菌毒素限量控制要求。