七尾霉素的研究 1 玫瑰链霉菌高产菌株的筛选

玫瑰链霉菌能登亚种OS-3966(Streptomyces rosa subsp.notoensis OS-3966)经紫外线和亚硝基胍处理,研究了变株产生七尾霉素能力的变化。利用紫外线和咖啡因复合诱变处理母株,筛得了500-90-1,500-90-5,500-150-1和500-120-1等高产变株,七尾霉素的产量比母株提高了近3倍,其产物组分与母株相同。同时观察了这些变株在各种培养基上的培养特征。

玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及功能鉴定

目的:克隆玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因(Srt)使其在大肠杆菌XL10-Gold中高效表达,并对重组酶的酶学特性进行研究。方法:利用PCR技术从玫瑰链霉菌中克隆到一段长1 704bp的海藻糖合成酶基因(Srt),构建重组表达质粒pSE380-Srt-treS,将其转化大肠杆菌XL10-Gold中诱导表达,对重组纯酶进行SDS-PAGE分析及酶学特性测定。结果:SDS-PAGE显示在65kDa处有明显单一蛋白条带。该酶可催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆反应,海藻糖得率达82%,且含有很低的副产物葡萄糖(5%左右)。最适反应温度和pH分别为30℃、7.5,Cu2+、Zn2+和Tris能明显抑制酶活力。该酶还可催化蔗糖生成一种无龋齿,适合糖尿病患者食用的糖类-海藻酮糖。结论:成功克隆表达了一个海藻糖合成酶基因,该酶转化率高,副产物较少,为工业酶法生产海藻糖奠定基础。

激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株

将经过20 mW激光辐照20 min的达托霉素(Daptomycin)生产菌株-玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)D-38的孢子悬液倾注在含有1．9λg／mL链霉素的高氏一号培养平板上。通过链霉素抗性法筛选获得了10％正变率的突变株,其中突变株LC-54摇瓶发酵单位为81．2 mg／L,比出发菌株提高了39％。

玫瑰红链霉菌336质粒（pSR336）DNA的分离及特性研究

从葡萄糖异构酶产生菌──玫瑰红链霉菌３３６中分离得到质粒ｐＳＲ３３６。经电泳检测和电镜观察证实，存在共价闭合超螺旋和开环两种分子构型，分子量约为６．３５ｋｂ，拷贝数约为１３０。采用高温（４０℃），吖啶橙、溴化乙锭和ＳＤＳ等物理、化学因素消除ｐＳＲ３３６，均未获得质粒消除株，表明ｐＳＲ３３６质粒是非常稳定的。用变铅青链霉菌ＴＫ２１作受体，进行平皿杂交以检测ｐＳＲ３３６的接合转移能力，未观察到麻点（ｐｏｃｋ）的形成。用ＨｉｎｄⅢ分别酶切ｐＳＲ３３６和ｐＩＪ４８６，连接得到一个嵌合质粒ｐＩＲ３０，检测玫瑰红链霉菌３３６（ｐＳＲ３３６）、变铅青链霉菌ＴＫ５４（ｐＩＲ３０）、变铅青链霉菌ＴＫ５４（ｐＩＪ４８６）及变铅青链霉菌ＴＫ５４这４株菌的葡萄糖异构酶活性及对硫链丝菌肽等２１种抗生素的抗性，结果表明ｐＳＲ３３６与葡萄糖异构酶的产生没有明显的联系；该质粒不含有硫链丝菌肽等１６种抗生素的抗性，是否含有庐山霉素、洋红霉素、莫能菌素、春雷霉素这４种抗生素和乳链菌肽的抗性尚需进一步加以确定。

葡萄糖异构酶产生菌——玫瑰红链霉菌336质粒pSR336限制酶图谱的建立

开发新的克隆载体依然是链霉菌基因克隆的一项重要基础工作。我们首次从葡萄糖异构酶产生菌——玫瑰红链霉菌(Streptomyces roseoru-her)336中分离到质粒pSR336。

玫瑰孢链霉菌NRRL11379产达托霉素前体物A21978C的发酵培养基优化

[目的]对玫瑰孢链霉菌NRRL 11379进行发酵培养基优化,寻找产物A21978C较好的发酵培养基配方。[方法]从16种发酵培养基中筛选较好的培养基,通过单因子试验和正交试验进行优化。[结果]得到玫瑰孢链霉菌NRRL 11379产达托霉素前体物A21978C组分的最佳发酵培养基为:葡萄糖1%、可溶性淀粉4%、黄豆粉1%(、NH4)2SO40.3%、MOPS 6%、K2SO40.8%、NaCl 0.1%。[结论]优化后的产量约为60 mg/L,比优化前提高9.2倍。

玫瑰孢链霉菌SWU2010遗传转化体系的建立和优化

玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)是近几年备受关注的抗生素—达托霉素(Daptomycin)的产生菌,具有重要的研究价值和应用前景.目的:为了对Streptomyces roseosporus中的功能基因进行研究,构建达托霉素高产菌株,需要建立一种稳定、高效的遗传转化体系.方法:以pSET152和pKC1139为载体,探索优化了S.roseosporus SWU2010与大肠杆菌进行接合转移的条件,以此为基础将体外构建的ploxP质粒和带有cre重组酶基因的质粒pALcre先后转入S.roseosporus SWU2010中.结果:AS-1培养基是接合转移的最佳培养基;孢子的预萌发条件为50℃热激10 min,转化效率达10-6～10-5.另外,抗生素覆盖时间16～18 h效果最好.利用已建立的接合转移体系,成功将两侧带有loxP位点的安普霉素抗性基因成功敲除.实验结果为进一步研究达托霉素的生物合成基因和对达托霉素进行组合生物合成改造奠定了基础.

玫瑰孢链霉菌补料分批发酵生产达托霉素的动力学模型

目的研究了玫瑰孢链霉菌补料分批发酵生产达托霉素的动力学特性。方法将发酵过程分为菌体生长阶段和达托霉素合成阶段,基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,对达托霉素发酵过程建立了菌体生长、产物生成和总糖消耗的动力学模型,并利用Statistica 6.0软件对模型参数进行非线性拟合。结果表明模型预测值和实验数据拟合较好,模型能够较好地反映达托霉素补料分批发酵过程。结论建立的模型能够为高效生产达托霉素提供行之有效的调控策略与手段。

玫瑰孢链霉菌基因组挖掘研究进展

玫瑰孢链霉菌是重要抗生素达托霉素的产生菌。基因组挖掘发现该菌具有丰富的次级代谢产物合成潜力,激活沉默次级代谢产物生物合成基因簇,发现了10多种具有多种生物活性的次级代谢产物。本文回顾了玫瑰孢链霉菌次级代谢产物的研究进展,以及激活这些沉默生物合成基因簇的研究策略。这些研究为其他链霉菌基因组挖掘提供了有效的思路和方法学参考。

达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统的建立与优化

玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379是一种具有环脂肽结构抗生素-达托霉素(Daptomycin)的产生菌。建立高效稳定的遗传操作系统是研究该链霉菌各功能基因作用以及构建基因工程菌的基础。实验探索了通过电穿孔、接合转移向玫瑰孢链霉菌中转入外源DNA的可能性。以链霉菌(Streptomyces)噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152-dptP为出发质粒,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体作为受体菌,在不同的电场强度下进行电穿孔实验,结果表明:以玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体为受体菌,未获得转化子。以ET12567(PUZ8002,pSET152-dptP)为供体,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体为受体,选取MS培养基为接合转移培养基,利用属间接合转移将质粒pSET152-dptP转入菌株NRRL11379中。结果表明:当供体大肠杆菌ET12567细胞量和玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌丝体量比例为1∶1,MS培养基中MgCl2的浓度为0.01 mol/L,培养20 h后覆盖阿泊拉霉素50μg/mL以及萘啶酮酸50μg/mL时,接合转移频率最高,可达1.75×10-4。通过PCR验证,质粒pSET152-dptP已整合至玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株的染色体上。确定了玫瑰孢链霉菌属间接合转移的最佳条件。

壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌菌体蛋白差异表达分析

建立了有效分析浅玫瑰色链霉菌菌体全蛋白质的方法,使用分离范围为p H 4-7的IPG胶条、2D clean-up试剂盒法纯化方法、80μg蛋白质上样量和银染的双向电泳技术,获得了低背景、高分辨率和重复率、无明显条纹的浅玫瑰色链霉菌全蛋白质双向电泳图谱。通过Image Master2D Platinum7.0软件对壳聚糖诱导条件下浅玫瑰色链霉菌菌体总蛋白质的电泳图谱进行匹配分析,在诱导菌株图谱上有723±14个清晰可见的蛋白质点可供差异分析。与未诱导菌株的双向电泳图谱对比结果显示：18个蛋白质点在诱导菌株中差异表达,其中14个蛋白质点的表达量上调,4个蛋白质点的表达量下调,选取10个差异表达量在5倍以上的蛋白质点进行质谱鉴定,结果显示,延长因子Tu、RNA聚合酶、分子伴侣等蛋白在壳聚糖诱导下表达量增加,表明它们在浅玫瑰色链霉菌代谢壳聚糖的过程中起重要作用。

癸酸抗性突变株流加发酵法生产达托霉素

采用He-Ne激光对达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌LC-54进行诱变,筛选前体癸酸抗性突变株,在此基础上进一步考察了一次补料、间歇补料和恒速流加补料等不同补料策略对达托霉素发酵生产的影响．结果表明,选育前体癸酸抗性突变株可以提高达托霉素的生产能力,并最终获得了达托霉素发酵效价较出发菌株提高了37．2%的高产突变株LC-KS-54．采用恒速流加策略,能够有效地提高达托霉素产量,经过130 h的恒速流加培养,细胞干重达到15．4g/L,达托霉素产量达到258 mg/L,明显优于其他前体补料策略．

组合抗性筛选法选育达托霉素高产菌株

目的利用组合抗性筛选法选育达托霉素高产菌株。方法以玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus ATCC 11379)为出发菌株,通过在不同浓度梯度的达托霉素和链霉素复合抗性平板上进行抗性筛选。结果筛选到一株高产达托霉素的突变株D1000-S3-2,经摇瓶发酵验证达托霉素发酵单位可达59mg/L,比出发菌株提高了63.8%。结论实验证明组合抗性筛选是一种简单高效筛选方法。

响应面法优化达托霉素发酵培养基

采用响应面法对玫瑰孢链霉菌发酵产达托霉素的培养基进行了优化。首先通过Placket-Burman设计法筛选出影响达托霉素产量的4个重要因素:初始pH值、葡萄糖、L-天冬氨酸(L-Asp)、硫酸钾。其中初始pH值的影响极为显著(p<0.01),因此,对初始pH值进行了单因素试验,得到最优初始pH值为8.6。在此基础上对其余3个因素用最陡爬坡路径逼近最大响应区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得到最适培养基组成为:葡萄糖13.0 g/L、L-Asp 2.6 g/L、硫酸钾4.1 g/L。在此优化条件下,达托霉素产量达373.98 mg/L,与预测值(365.76 mg/L)非常接近,比优化前产量提高了2.25倍。

抗肿瘤海洋放线菌LYG-1的筛选及分类鉴定(英文)

从连云港海域海泥中分离得到一株具有抗肿瘤活性海洋放线菌LYG-1,通过对其形态特征、培养特征、生理生化特性的研究以及16S rRNA基因序列分析,将海洋放线菌LYG-1归属为链霉菌属玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseos-porus)的新的海洋变种。利用MTT法对海洋放线菌LYG-1发酵产物的抗肿瘤活性进行了初步研究,结果表明放线菌LYG-1的发酵原液对HepG2、MCF-7、HCT116以及MDA-MB-231 4种肿瘤细胞具有良好的体外抗肿瘤活性。

原生质体紫外诱变选育达托霉素高产菌株

研究了达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌D-30原生质体制备及再生的条件。结果显示,D-30原生质体制备及再生的最适条件为:在种子培养基中添加0.6%的甘氨酸,当种子培养30h后,用浓度为2mg·mL-1的溶菌酶破壁,酶解温度为32℃,酶解时间为75min。在最适条件下制得的原生质体经紫外诱变处理后培养,最终筛选得到高产菌株D-35,该菌株的平均发酵单位较出发菌株提高了87.9%。

达托霉素高产菌株选育及发酵条件优化

目的通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,并对其发酵条件优化,以提高其达托霉素发酵水平,降低生产成本。方法以玫瑰孢链霉菌(DT-9#F2)为出发菌株,分别采用紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变及复合诱变并结合链霉素抗性筛选进行菌株选育,同时,对其发酵培养基中氮源、碳源及生长因子进行优化,以进一步提高其发酵产量。结果得到一株达托霉素高产突变株DT-37,其摇瓶发酵产量达到12.2mg/L,较出发菌株提高20.79%;优化后的发酵培养基为:酵母粉(YP300)1.65%、FeSO40.043%、葡萄糖1.50%、玉米淀粉7.20%、糖蜜0.72%,VB12 1.50μg/mL、硫辛酸5.00μg/mL。其摇瓶发酵产量达到30.56mg/L,较初始培养基提高了297.92%。经100L发酵罐上放大验证,达托霉素的产量达到了2872mg/L,较优化前提高了14.88%。结论紫外、微波及LiCl复合诱变后经抗生素抗性筛选,结合发酵培养基优化,可有效提高菌株的达托霉素发酵产量。

达托霉素生产菌的激光诱变及组合抗性筛选

本文结合He-Na激光诱变技术及抗生素抗性筛选方法选育达托霉素高产菌株。以达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌DA15-2为出发菌株,利用激光技术进行诱变育种,结果通过对致死率和正突变率的考察,适宜的诱变剂量为辅照功率20 mW及辅照时间20 min。在不同浓度梯度的达托霉素及链霉菌复合抗性平板上筛选诱变后的菌株,筛选到一株产达托霉素发酵单位100 mg/L的菌株DA15-23,比出发菌株提高了75.8%。实验证明结合激光诱变及抗生素抗性筛选得到了高产达托霉素的菌株。

癸酸钠抗性菌株产达托霉素的发酵补料策略

为提高达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌的发酵能力,通过筛选癸酸钠抗性菌株,优化其发酵瓶补加正癸酸的方法,提高达托霉素的摇瓶效价值。首先对原始菌株进行癸酸钠抗性选育,筛选出一株空白摇瓶效价值为43.4 mg·L^(-1)的菌株TR21-29,利用该菌株对癸酸盐的耐受性,验证其发酵瓶补加正癸酸的最优方式。主要考察正癸酸的耦合剂,向发酵瓶添加正癸酸的补料时间、补料浓度和补料间隔,确定发酵过程中补加正癸酸的关键参数。结果表明:补料可将抗性菌株TR21-29的原始效价值由43.4 mg·L^(-1)提高至138.1 mg·L^(-1),提高率为218.2%。补料方式为配制0.5 g·mL^(-1)的正癸酸溶液,在发酵瓶培养24 h后开始补加,补料终浓度为1.5 mmol·L^(-1),补料间隔为4 h。

生物转化法合成16α-羟基泼尼松龙的发酵工艺研究

目的:研究1株玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)的发酵培养基和底物转化条件,以提高16α-羟基泼尼松龙的转化率。方法:采用紫外与氯化锂复合诱变获得目的菌株TS-58,利用正交实验等方法考查摇瓶发酵条件,研究不同浓度的碳源、氮源对玫瑰产色链霉菌生长的影响,以及不同底物浓度、底物加入时间、装液量、金属离子和添加助溶剂等条件对转化生成16α-羟基泼尼松龙能力的影响。结果:获得最佳转化培养基为葡萄糖10 g/L、可溶性淀粉50 g/L、蛋白胨10 g/L、黄豆饼粉25 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、硫酸镁0.5 g/L硫酸锌0.5 g/L。在底物投料量5 mg/mL添加0.8 mg/ml PEG助溶剂的最优条件下,16α-羟基泼尼松龙的转化率达到了13.8%。结论:突变株Streptomyces roseochromogenes TS-58能有效地在泼尼松龙上引入16α-羟基羟基,为工业生产16α-羟基泼尼松龙奠定了基础。