铜绿假单胞菌PAO1中环二鸟苷单磷酸代谢蛋白PA0285感应环境因素的研究

目的分析铜绿假单胞菌中环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)代谢蛋白PA0285感应环境因素的作用,探讨其参与c-di-GMP信号转导的机制。方法通过PCR技术对pa0285转座子突变菌株进行遗传背景确认;以铜绿假单胞菌野生型PAO1和2株PA0285插入失活突变菌株为研究对象,选定24种化合物,利用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合法及刚果红结合试验,检测细菌胞内c-di-GMP水平;通过生物膜定量试验分析特定环境因素对细菌生物膜形成的影响;使用CAS平板法进一步分析PA0285在特定环境条件下对细菌分泌嗜铁素的调控。结果细菌基因组PCR结果表明转座子插入致pa0285基因失活;GFP报告基因融合法、刚果红结合试验及生物膜定量检测结果显示,与野生型PAO1相比,突变菌Δpa0285胞内c-di-GMP水平升高(F=88.92,P<0.01),生物膜合成增加(F=15.82,P<0.01);将异亮氨酸(Ile)或缬氨酸(Val)添加至培养基时,突变菌Δpa0285胞内c-di-GMP水平与PAO1相比降低(F=15.17,60.17,P<0.01),生物膜合成与PAO1比较差异无统计学意义(F=3.462,0.5018,P=0.10001,0.6287)。CAS定量检测结果显示,与野生型PAO1相比,突变菌Δpa0285分泌嗜铁素含量下降(F=58.22,P<0.01);CAS平板观察结果显示,无外源化合物添加时,突变菌Δpa0285菌落的螯合圈与野生型PAO1相比偏小,将精氨酸(Arg)、MgCl2、CaCl2添加至培养基时,突变菌Δpa0285的菌落螯合圈与PAO1相比大小相近;将Val和Ile添加至培养基时,突变菌Δpa0285的菌落螯合圈与野生型PAO1相比偏大。结论铜绿假单胞菌PAO1中代谢蛋白PA0285具有磷酸二酯酶(PDE)的活性;PA0285通过调控胞内c-di-GMP水平,进而影响生物膜合成及嗜铁素的分泌,以感应环境中氨基酸Val和Ile。

环二鸟苷单磷酸核糖开关的结构与功能

环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是细菌中广泛存在的一类核苷类第二信使分子,能够调控细菌的生物被膜形成、运动性、黏附、毒力以及胞外多糖的产生等众多生理活动。核糖开关是m RNA 5′-非翻译区(5′-Untranslational region,5′-UTR)的一段RNA序列,包含可以识别并结合配体的保守序列——适配体区(Aptamer domain,AD),以及结构多变、可以调控下游编码基因的表达平台区(Expression platform,EP)。当代谢物分子浓度比较高时,其与适配体区结合,引起下游的表达平台区发生构象变化,进而实现对下游基因的调节。目前已发现c-di-GMP-Ⅰ和c-di-GMP-Ⅱ两类c-di-GMP的核糖开关。它们通过特异性地结合c-di-GMP,调控种类繁多的下游基因的表达。c-di-GMP-I核糖开关分布广泛,尤其在厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的细菌中最为丰富。c-di-GMP-Ⅱ核糖开关具备变构核酶的功能,结合c-di-GMP后在其非典型剪切位点处发生结构变化,调节下游基因表达。文中围绕c-di-GMP核糖开关的发现、功能、分类以及下游调控基因的功能进行综述与分析。

外源性单磷酸鸟苷环二聚体防龋的实验研究

目的初步探讨外源性单磷酸鸟苷环二聚体(c-di-GMP)对大鼠口腔内龋齿的防龋效果。方法 SPF大鼠感染致龋菌后,随机分成3组,分别用外源性c-di-GMP、氟化钠水溶液、质量体积比为0.9%氯化钠给大鼠施药,用唾液取样细菌培养、龋齿记分观察外源性c-di-GMP在动物口内对致龋菌的生长繁殖以及对龋病发生、发展的影响。结果通过唾液取样进行变形链球菌培养计数,c-di-GMP组与阴性对照组相比,无显著性差别(P>0.05);Keyes龋齿记分结果显示,c-di-GMP组龋损程度及数量都均少于对照组(P<0.05),从龋病发展程度看,c-di-GMP组最为缓慢,仅存在釉质和牙本质浅层龋损。结论外源性c-di-GMP可以有效抑制大鼠龋齿的发生和发展,有望成为一种新型防龋药物。

外源性单磷酸鸟苷环二聚体对变形链球菌基因表达的影响

背景:前期研究证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路,该通路介导变形链球菌的生物膜形成及在体外牙釉质表面的黏附。目的:以基因芯片技术分析单磷酸鸟苷环二聚体对变形链球菌生物学特性的影响。方法:以外源性单磷酸鸟苷环二聚体干预变形链球菌UA159,提取其总RNA,并以标准菌株的总RNA作为对照,与变形链球菌全基因组芯片杂交,筛选差异基因。结果与结论:外源性单磷酸鸟苷环二聚体干预后,变形链球菌中glgA、glgB、msmF、gftA、lacG、lepB、rgpAc、bacC、apt69个基因表达上调,Hrc、ProC、HprT、Pdp、Glk、cdsA共6个基因表达下调。所获得的差异基因主要与细胞趋向性和生物膜形成、信号转导、糖代谢、等途径相关。说明单磷酸鸟苷环二聚体影响变形链球菌的致龋性。

外源性单磷酸鸟苷环二聚体抑制变形链球菌生物膜的形成能力

背景:有研究发现外源性的单磷酸鸟苷环二聚体(bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosinemonophosphate,c-di-GMP)能够抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,且作用呈剂量依赖性。目的:观察外源性c-di-GMP对变形链球菌生物膜形成能力的影响。方法:将不同浓度(0,2,20,200,400μmol/L)外源性c-di-GMP作用于变形链球菌生物膜48h,使用酶标仪测定吸光度值,观测生物膜形成量的改变,以生理盐水作为阴性对照。同时在离体牙的新鲜釉质片上形成变形链球菌生物膜,以200μmol/L的c-di-GMP与生理盐水分别作用于生物膜48h,扫描电镜观察结构的改变。结果与结论:与阴性对照组比较,c-di-GMP明显抑制了变形链球菌生物膜的形成,而且这种抑制成剂量依赖关系,当c-di-GMP浓度为200μmol/L时,变形链球菌生物膜的形成能力下降了65%左右,达到400μmol/L时,生物膜的形成能力几乎被完全抑制(P<0.05)。扫描电镜结果显示,c-di-GMP处理组细菌排列无明显规律,细胞外基质减少。表明c-di-GMP可以抑制变形链球菌的生物膜形成能力。