环二鸟苷酸调控铜绿假单胞菌生物被膜研究进展

从浮游到生物被膜(BF)生命周期的转变能够促进细菌对非生物表面的黏附,逃避宿主免疫系统,增强其对常见抗菌药物的抗性,在导致人类病原菌感染率不断增加的同时,也大大增加了临床治疗的难度。第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)对BF的调控起重要作用。通过直接靶向c-di-GMP信号传导抑制抗菌药物抗性和BF形成意义重大。文章对c-di-GMP在铜绿假单胞菌BF调控中的作用进行综述。

环二鸟苷酸调控细菌胞外多糖生物合成的研究进展

细菌胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)是细菌生长代谢过程中自身合成并分泌到细胞壁外的一种次级代谢产物,可以调节细胞对不同基质的初始附着,保护细胞抗环境胁迫和脱水。作为潜在的益生元,EPS具有安全,无毒和特殊的理化性质,广泛应用在食品、医药、生物和工业等领域。然而,细菌代谢系统复杂,EPS的生物合成机制仍未得到全面解析。环二鸟苷酸(Cyclic diguanylate,c-di-GMP)作为一类重要的第二信使,在细菌的生物被膜形成、运动性、黏附、毒力以及EPS合成等众多生理活动上发挥重要的调控作用。c-di-GMP转录调控机制的解析,为探明细菌EPS的生物合成机理提供了全新的思路。本文详细总结了c-di-GMP的特性及合成降解途径,重点综述c-di-GMP在介导细菌EPS生物合成过程中的调控机理。本篇综述为揭示细菌EPS生物合成机理和构效关系的研究提供理论基础。

细菌环二鸟苷酸介导的信号转导途径研究进展

环二鸟苷酸(c-di-GMP)是在细菌中广泛存在的第二信使分子,它介导的信号转导途径涉及调控细菌的运动、致病性、生物膜形成、细胞周期进程和有机溶剂耐受性等多种重要功能.该文主要从c-di-GMP的合成与降解、c-di-GMP的效应子及c-di-GMP的生理作用3方面对c-di-GMP介导的信号转导途径进行总结,并对该信号转导途径的研究前景进行了展望.

环二鸟苷酸(c-di-GMP)作为潜在免疫佐剂的研究进展

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,近年来研究发现环二鸟苷酸作为免疫调节剂作用于真核细胞可产生良好的免疫调节作用,实验研究表明其有可能成为具有潜力的疫苗佐剂。本文综述了c-di-GMP的结构,生物学功能、免疫特性和作为疫苗佐剂研究等方面的最新研究进展。

黄单胞菌中c-di-GMP二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶的生物信息学分析

黄单胞菌是一类重要的作物病原菌,其信号转导机制及其与寄主植物的相互作用一直是微生物学、植物病理学及植物学工作者研究的热点问题。c-di-GMP是一种广泛存在于细菌中的第二信使分子,参与细菌的粘附、胞外多糖的合成、生物膜形成、运动性及毒力等许多细菌生理过程的调节。c-di-GMP主要由含有GG(D/E)EF结构域的二鸟苷酸环化酶合成,由含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶降解,其在胞内的浓度受到二鸟苷酸环化酶与c-di-GMP特异性磷酸二酯酶的协同调节。本文对黄单胞菌属中十五株具有完整基因组序列的菌株中含有这三类结构域的蛋白进行了包括分布规律、进化树、COG及GO分析在内的生物信息学分析,揭示了GG(D/E)EF、EAL与HD-GYP结构域蛋白在黄单胞菌属中的进化差异及其与侵染对象的关联性;研究结果也表明这些结构域蛋白主要为信号转导蛋白,参与基因转录和细胞运动。这些结果为构建c-di-GMP介导的调控网络和寻找新的控制黄单胞菌的药物靶标奠定了良好的基础。

外源性单磷酸鸟苷环二聚体对变形链球菌基因表达的影响

背景:前期研究证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路,该通路介导变形链球菌的生物膜形成及在体外牙釉质表面的黏附。目的:以基因芯片技术分析单磷酸鸟苷环二聚体对变形链球菌生物学特性的影响。方法:以外源性单磷酸鸟苷环二聚体干预变形链球菌UA159,提取其总RNA,并以标准菌株的总RNA作为对照,与变形链球菌全基因组芯片杂交,筛选差异基因。结果与结论:外源性单磷酸鸟苷环二聚体干预后,变形链球菌中glgA、glgB、msmF、gftA、lacG、lepB、rgpAc、bacC、apt69个基因表达上调,Hrc、ProC、HprT、Pdp、Glk、cdsA共6个基因表达下调。所获得的差异基因主要与细胞趋向性和生物膜形成、信号转导、糖代谢、等途径相关。说明单磷酸鸟苷环二聚体影响变形链球菌的致龋性。

环二鸟苷酸——新型的细菌第二信使

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是新近发现的在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,包括细胞分化、从运动状态到生物被膜状态的转变、致病因子产生等.基于其对细菌抗生素耐药的物理屏障—生物被膜形成的影响,c-di-GMP的研究越来越受到人们的关注.细胞内c-di-GMP的产生受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解两条途径调控.在结构上,通常DGC含有GGDEF结构域,PDE含有EAL结构域.c-di-GMP的作用靶点包括PilZ结构域和GEMM核开关两种类型.本文综述了c-di-GMP的代谢途径、调控机理、生物学功能等方面的最新研究进展,并对c-di-GMP在今后研究中的应用和发展趋势进行展望.

环二鸟苷酸与铜绿假单胞菌形成生物膜的相关性研究

目的:通过构建环二鸟苷酸降解酶磷脂酶D基因突变株,探讨环二鸟苷酸与铜绿假单胞菌形成生物膜的相关性。方法:采用基因工程技术构建磷脂酶D基因突变质粒,通过同源重组转化至野生型铜绿假单胞菌PAO1,抗性筛选获得基因突变株bf-。扫描电子显微镜下观察基因突变株与野生菌株生物膜表型的差异。结果:与野生菌株相比,基因突变株bf-细菌微克隆的形成增加,有利于细菌在导管材料表面形成生物膜。结论:环二鸟苷酸的增加可促进细菌生物膜的形成,与铜绿假单胞菌引起的院内感染和耐药性密切相关。

外源性单磷酸鸟苷环二聚体抑制变形链球菌生物膜的形成能力

背景:有研究发现外源性的单磷酸鸟苷环二聚体(bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosinemonophosphate,c-di-GMP)能够抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,且作用呈剂量依赖性。目的:观察外源性c-di-GMP对变形链球菌生物膜形成能力的影响。方法:将不同浓度(0,2,20,200,400μmol/L)外源性c-di-GMP作用于变形链球菌生物膜48h,使用酶标仪测定吸光度值,观测生物膜形成量的改变,以生理盐水作为阴性对照。同时在离体牙的新鲜釉质片上形成变形链球菌生物膜,以200μmol/L的c-di-GMP与生理盐水分别作用于生物膜48h,扫描电镜观察结构的改变。结果与结论:与阴性对照组比较,c-di-GMP明显抑制了变形链球菌生物膜的形成,而且这种抑制成剂量依赖关系,当c-di-GMP浓度为200μmol/L时,变形链球菌生物膜的形成能力下降了65%左右,达到400μmol/L时,生物膜的形成能力几乎被完全抑制(P<0.05)。扫描电镜结果显示,c-di-GMP处理组细菌排列无明显规律,细胞外基质减少。表明c-di-GMP可以抑制变形链球菌的生物膜形成能力。

环二鸟苷酸对M1型巨噬细胞极化及促炎作用的体外研究

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌毒力因子环二鸟苷酸(c-di-GMP)对M1型巨噬细胞极化的调控作用及其体外促炎作用。方法:使用不同质量浓度(0.25、1、4、16、64μg/m L)的c-di-GMP分别处理RAW 264.7细胞3、6、12、24 h,采用实时定量RTPCR、ELISA及流式细胞术检测炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6以及巨噬细胞M1型极化标志细胞因子IL-23和M2型极化标志细胞因子IL-10的mRNA、蛋白质和细胞表面标志物的表达。结果:RAW 264.7细胞TNF-α、IL-6和IL-23的mRNA表达水平随c-di-GMP的浓度和时间的变化均有不同程度的增高,具有剂量和时间依赖性,而IL-10的表达水平在各组中无显著升高;ELISA结果与实时定量RT-PCR结果基本相同;流式细胞术结果显示在c-di-GMP刺激RAW 264.7细胞24h后,细胞表面分子F4/80与CD86双阳性率、CD86单阳性率明显增高。结论:c-di-GMP能够刺激M1型巨噬细胞相关细胞因子IL-23及炎症因子TNF-α和IL-6的表达,诱导巨噬细胞发生M1型巨噬细胞极化,进而导致炎症反应,提示c-di-GMP可能通过诱导巨噬细胞发生M1型极化,进而在牙周炎的发生、发展过程中发挥重要作用。

新型免疫佐剂环二鸟苷酸的制备与纯化

目的制备新型免疫佐剂环二鸟苷酸(c-di-GMP)并进行纯化。方法利用前期重组构建并在大肠杆菌中成功表达的霍乱弧菌VCA0956蛋白(含有GGDEF结构域)作为合成酶,在反应体系中采用酶促反应将2分子鸟苷酸GTP催化缩合成一分子c-di-GMP。利用反相液相色谱仪分离纯化粗产物中的c-di-GMP,柱温25℃,流动相为乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(体积比为5∶95逐渐变为30∶70),流速1 m L/min。结果 c-di-GMP从反应粗产物中被有效的分离纯化,同时,经质谱分析仪分析鉴定,获得高纯度的c-di-GMP。结论成功从酶促反应体系中分离并纯化了c-di-GMP。

D-甲硫氨酸通过降低环二鸟苷酸清除牙龈卟啉单胞菌生物膜

目的探讨D-甲硫氨酸(D-methionine,D-Met)通过调控环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)清除牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用机制。方法通过细胞活性、最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)实验确定D-Met的有效浓度。分别在牙龈卟啉单胞菌生物膜形成抑制实验和成熟生物膜裂解实验中加入不同浓度的D-Met,检测生物膜生物量、胞外多糖量、生物膜形态、细胞膜完整性以及c-di-GMP的含量变化。结果 D-Met <40 mmol/L为生物安全浓度。在生物膜形成抑制和成熟生物膜裂解实验中,D-Met≥20 mmol/L降低了生物膜生物量和胞外多糖量。扫描电镜结果显示,D-Met≥20 mmol/L时,细胞外基质和细菌密度显著降低。透射电镜结果表明,35 mmol/L D-Met在生物膜形成过程中导致了细胞膜破裂,并增加了成熟生物膜裂解时细胞膜的通透性。Cdi-GMP水平随着D-Met浓度的增加而降低,呈浓度依赖性。结论 D-Met≥20 mmol/L可通过抑制c-di-GMP水平清除牙龈卟啉单胞菌生物膜。

环二鸟苷酸调控细菌生物膜形成的研究进展

生物膜(BF)是细菌附着到接触物表面形成的多细胞群体,生物膜的形成不仅有利于细菌的生存,同时也增强了感染性。环二鸟苷酸(C-di-GMP)是群体感应系统中的一种重要的胞内信号分子。包含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)可将两分子的GTP合成C-di-GMP,并在含有EAL和HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)作用下水解。C-di-GMP的水平在这两种酶调节下发生改变,通过影响下游受体调控细菌的毒性、运动性、纤维素合成、黏附性、生物膜形成等多种功能。本文就细菌生物膜形成和C-di-GMP的调节作用的研究进展做一综述。

环二鸟苷酸对铜绿假单胞菌生物被膜的调控研究

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是细菌中存在的众多信使分子之一,参与调节多种生理功能,包括细菌的信号传递、内外环境调理、生物被膜形成等。考虑其对细菌抗生素耐药的物理屏障——生物被膜(biofilm,BF)形成的影响,c-di-GMP的研究越来越受到人们的关注。由磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解和二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)的合成两条途径对细菌内c-di-GMP进行调控,PDE和DGC共处于同一个蛋白中,是一个双功能蛋白酶的两个区域。本文通过综述c-di-GMP的代谢途径、生物学功能以及对铜绿假单胞菌生物被膜调控研究的最新结果,对c-di-GMP在今后研究中的应用和发展趋势进行展望。

环二鸟苷酸对细菌运动调控的研究进展

细菌中的第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)对细菌的运动性有调节作用.c-di-GMP调控鞭毛的生物合成、菌毛形成和菌毛蛋白的组成,以及其他一些与运动相关的蛋白的合成.细菌的运动性与其毒力、致病性、粘附性、趋化性、生物膜组成等密切相关.在革兰氏阴性细菌中,关于c-di-GMP的信号通路的研究较为清晰,而在革兰氏阳性细菌中,关于该信号转导通路的研究较少.此外,有关c-di-GMP的信号通路的研究主要集中在病原菌.该文主要综述了一些常见病原菌中c-di-GMP对其运动性的调控机制,为研究其他细菌c-di-GMP信号通路提供思路.

环二鸟苷酸在生物膜形成中作用的研究进展

耐药细菌的不断出现和传播严重威胁人类健康[1]。生物膜是导致耐药的一种重要机制,并且多数细菌感染与之相关。生物膜通过一系列不同的机制,使生物膜内的细菌对抗生素和消毒剂的抵抗能力显著高于浮游菌,如生物膜基质对抗生素的抗渗性、生物膜核心部位细菌的生长速率降低、存在耐受抗生素的持留菌和生物膜内细菌外排泵过表达,并引起持续感染,是治疗失败的主要原因[2]。

胰岛素对胞内不同水平环二鸟苷酸铜绿假单胞菌运动能力的影响

目的探讨胰岛素对胞内环二鸟苷酸(Cyclic diguanosine-5'-monophosphate,c-di-GMP)浓度表达不同的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)运动能力的影响,为进一步研究胰岛素对胞内c-di-GMP浓度表达不同的PA在糖尿病小鼠模型中的作用提供基础。方法按胞内c-di-GMP表达量不同分为对照野生PAO1组、胞内c-di-GMP低表达PAO1/Plac-yhjH组和胞内c-di-GMP过表达PAO1/ΔwspF组。将三种菌株接种于无胰岛素的琼脂中,测定运动环直径以评估不同菌株的泳动、群集和蹭动能力。然后再将三种菌株接种于分别含有200nU/ml、200μU/ml和200mU/ml浓度胰岛素的琼脂中,分析不同菌株在胰岛素干预后其运动能力的变化。结果在无胰岛素干预下,与PAO1组相比,PAO1/ΔwspF组运动能力明显被抑制,相反PAO1/Plac-yhjH组的运动能力则稍提高。在PAO1、PAO1/Plac-yhjH菌株中,与热变性胰岛素对照组相比,含有200mU/ml、200μU/ml、200nU/ml三种胰岛素浓度组的泳动、群集运动直径都明显变小,差异具有统计学意义(P<0.05),且在三个浓度之间菌株的泳动、群集能力无统计学差异,其影响与胰岛素无剂量依赖性。结论胰岛素能抑制PA野生菌株及细胞内c-di-GMP低表达菌株的泳动、群集能力,且与胰岛素无剂量依赖性。

细菌环二鸟苷酸高效液相检测方法的建立

为建立适用于检测细菌菌环二鸟苷酸(C-di-GMP)的高效液相的方法,本文对高效液相的检测波长、流速和流动相等检测条件进行研究。研究结果确定的检测条件为:色谱柱:Diamonsil C18(2),150×4.6mm,5μm;进样体积20μL;流速0.5mL/min;检测波长253nm;流动相A为10mmol/L乙酸铵,流动相B为10mmol/L乙酸铵甲醇溶液,梯度洗脱。该条件下建立的标准曲线R2为0.994,加标回收率为88.2%~95.3%,精密度RSD为0.98%,可用于检测细菌中环二鸟苷酸。

硒代二半胱氨酸对白血病细胞系cAMP、cGMP及Ca^(++)的影响

本实验观察了硒代二半胱氨酸对白血病细胞系(U937和K562)第二信使的影响,旨在探讨其抑制白血病细胞生长和有丝分裂的机制。结果表明,经3.0μmol/L(半数抑制浓度)的硒代二半胱氨酸作用3天后,白血病细胞内cGMP和Ca^(++)含量明显降低,cAMP含量显著增高,CAMP/cGMP比值增大,从而抑制白血病细胞DNA合成期所需的胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性,抑制有丝分裂期微管蛋白的解聚,干扰有丝分裂过程,造成白血病细胞生长和增殖障碍。

氨基酸代谢变化引起的c-di-GMP稳态波动对大肠杆菌致病过程中菌毛合成的影响

[目的]细菌能够合成多种信号分子,调控自身在各种营养状态或应激条件下的生长代谢及毒力发挥。第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)在致病菌感应氨基酸饥饿(AAS)的过程中发挥重要作用,调控多种生理活动并显著影响其毒力发挥。本文旨在研究c-di-GMP在尿道致病性大肠杆菌(UPEC)尿道定殖及毒力发挥过程中的作用。[方法]采用尿液培养UPEC,结合转座子突变技术筛选氨基酸代谢相关生长缺陷基因,采用基因敲除技术、特定氨基酸回补及小鼠尿道感染模型验证尿液生长及尿道定殖缺陷表型;借助表达谱数据、RT-qPCR及β-半乳糖苷酶活性测定法筛选并鉴定受氨基酸饥饿影响的毒力基因及c-di-GMP相关基因;通过多基因敲除及回补技术、凝胶阻滞试验(EMSA)鉴定c-di-GMP对毒力基因的调控机制。[结果]精氨酸、异亮氨酸及蛋氨酸代谢失衡引起UPEC在尿液中生长缺陷,尿道定殖能力显著下降及局部c-di-GMP稳态破坏;YciR及YcgF相关c-di-GMP体系失衡显著下调菌毛基因簇表达;YciR通过调节子MlrA直接调控P菌毛基因簇表达;YcgF通过下游配对调节子YcgE直接调控P菌毛基因簇表达。[结论]c-di-GMP感应尿道定殖过程中的特定氨基酸饥饿,调控菌毛等黏附因子合成,促进UPEC完整毒力发挥。