建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的...建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。展开更多
为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和...为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。通过优化该方法的引物浓度、反应温度,并利用LAMP浊度仪测定扩增目的基因时出现白色焦磷酸镁的浊度值实时监控反应进程,初步建立了检测新孢子虫的LAMP方法,反应结束后通过加入SYBR Green I观察荧光对结果可视化判定。反应条件优化结果显示,引物F3/B3和FIP/BIP的终浓度分别为10 pmol/μL、20 pmol/μL,63℃扩增40 min效率最佳。利用该方法检测新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫、伊氏锥虫核酸,并在反应结束后加入SYBR Green I观察荧光以评估该方法的特异性。结果显示仅新孢子虫核酸扩增为阳性,其余病原核酸均为阴性结果。荧光观察结果显示,新孢子虫反应管呈翠绿色荧光(阳性),其他反应管呈橙黄色荧光(阴性);对重组质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板(即4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×100拷贝/μL)进行LAMP的敏感性试验,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为4.0×10^(1)拷贝/μL,且在反应结束后加入SYBR Green I,4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的反应管均呈翠绿色荧光(阳性),4.0×100拷贝/μL反应管呈橙黄色荧光(阴性),敏感性与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中荧光定量PCR方法的敏感性一致;分别以同一时间和不同时间提取的3个不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。综上表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。对895份临床疑似感染新孢子虫的动物肝脏、脑组织样品同时采用建立的LAMP方法及《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中的荧光定量PCR方法检测,结果显示LAMP的阳性检测率为41.45%(371/895),阴性率为58.55%(524/895),与SN/T 3499中的荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的新孢子虫LAMP方法快速、敏感、特异性强,且能够实时监测反应过程并能可视化判定结果,为新孢子虫现场快速检测提供了新的技术手段。展开更多
文摘建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。
文摘为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。通过优化该方法的引物浓度、反应温度,并利用LAMP浊度仪测定扩增目的基因时出现白色焦磷酸镁的浊度值实时监控反应进程,初步建立了检测新孢子虫的LAMP方法,反应结束后通过加入SYBR Green I观察荧光对结果可视化判定。反应条件优化结果显示,引物F3/B3和FIP/BIP的终浓度分别为10 pmol/μL、20 pmol/μL,63℃扩增40 min效率最佳。利用该方法检测新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫、伊氏锥虫核酸,并在反应结束后加入SYBR Green I观察荧光以评估该方法的特异性。结果显示仅新孢子虫核酸扩增为阳性,其余病原核酸均为阴性结果。荧光观察结果显示,新孢子虫反应管呈翠绿色荧光(阳性),其他反应管呈橙黄色荧光(阴性);对重组质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板(即4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×100拷贝/μL)进行LAMP的敏感性试验,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为4.0×10^(1)拷贝/μL,且在反应结束后加入SYBR Green I,4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的反应管均呈翠绿色荧光(阳性),4.0×100拷贝/μL反应管呈橙黄色荧光(阴性),敏感性与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中荧光定量PCR方法的敏感性一致;分别以同一时间和不同时间提取的3个不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。综上表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。对895份临床疑似感染新孢子虫的动物肝脏、脑组织样品同时采用建立的LAMP方法及《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中的荧光定量PCR方法检测,结果显示LAMP的阳性检测率为41.45%(371/895),阴性率为58.55%(524/895),与SN/T 3499中的荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的新孢子虫LAMP方法快速、敏感、特异性强,且能够实时监测反应过程并能可视化判定结果,为新孢子虫现场快速检测提供了新的技术手段。