荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的对比研究

目的对比荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用价值。方法随机在2020年1月~2023年1月天津市河东区疾病预防控制中心接收的呼吸道感染的患者中选取120例作为研究对象,分别采用荧光定量核酸扩增(PCR)检测技术与环介导等温扩增技术(LAMP)检测呼吸道病原体,并对检测结果进行比较分析。结果120例患者中使用LAMP检出细菌感染85例(阳性率为70.83%)。荧光定量PCR检出细菌感染72例(阳性率60.00%),差异无统计学意义(P>0.05);其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);采用荧光定量PCR与LAMP法对呼吸道感染10种病原体进行检测,结果表明,除LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检测一致性极好,荧光定量PCR对耐甲氧西林葡萄球菌的检测一致性极好(Kappa≥0.75),其余病原体采用荧光定量PCR与LAMP法检测一致性均中等(0.4≤Kappa<0.75)。结论荧光定量PCR与LAMP两种检测方法对呼吸道感染病原体检出率均较高,其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法。

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。

环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。

基于环介导等温扩增技术建立非洲猪瘟病毒的快速高灵敏度检测方法

非洲猪瘟是严重危害中国养猪业的传染病,为了快速检测非洲猪瘟,采用环介导等温扩增技术(LAMP),根据非洲猪瘟病毒p72基因保守序列设计环介导的等温扩增引物,然后进行引物筛选和反应条件优化。结果显示,优化后的反应体系在45 min时可检测低至1 copy/μL的非洲猪瘟病毒,不与其他病毒核酸样品产生交叉反应,可以裸眼判断检测结果,具有很好的灵敏性和特异性。

环介导等温扩增技术在农业病害检测中的应用综述

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸等温扩增技术,其原理是当温度为60~65℃时,DNA处于动态平衡状态,DNA双链打开,此时依赖Bst DNA聚合酶的链置换活性,使DNA可以在60~65℃的恒温下进行合成。其扩增引物是基于靶基因的6个特异性区域设计的,扩增阶段需要引物与样品DNA完全结合,才可以进行扩增,所以LAMP技术具有高特异性与高灵敏性。其反应温度恒定,不需要额外的控温设备,理想条件下仅需保温杯,即可进行DNA扩增。在田间检测时,只需提取样品总DNA,即可于田间进行病害检测,缩短了检测流程及时间,使病害检测更高效更便捷。在反应前或反应后加入特定染色剂,即可通过染色剂的变色情况进行反应结果的判定,使反应结果可视化。目前该技术已凭借其特异性高、灵敏性高、所用仪器简单(恒温水浴锅或保温杯即可)、检测效率高和检测结果可视化等优点,广泛应用于临床病原微生物检测、食品微生物检测、环境微生物检测、植物或微生物基因鉴定等领域。在农业病害的病原微生物(真菌、细菌、病毒、线虫)快速检测和诊断领域,已有很多研究针对各种病害建立了相应的LAMP检测技术。本文简要综述了LAMP技术原理、反应结果判定、优缺点和该技术目前在农业常见病原物检测中的应用,并对LAMP技术的应用前景进行了进一步的展望。

基于hipO基因的环介导等温核酸扩增技术检测食源性空肠弯曲菌

空肠弯曲杆菌是人细菌性胃肠炎的常见食源性致病菌之一,严重危害人类的健康,建立快速精准检测食源性空肠弯曲杆菌的方法,对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究建立了一种可视化、低成本基于hipO基因的环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测空肠弯曲菌的方法。该LAMP方法检测空肠弯曲菌CJFX01基因组DNA为阳性,而对肠出血性大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等食源性致病菌和胸膜肺炎放线杆菌Aha01、副猪嗜血杆菌Ahh01、多杀性巴氏杆菌Ahm03、猪链球菌Ahs02、猪丹毒丝菌Ahe01、支气管败血波氏杆菌Ahb01等猪源致病菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP检测空肠弯曲杆菌的检测限为5.4×10^(1)CFU/mL,而基于F3/B3引物对常规PCR的检测限为5.4×10^(6)CFU/mL,即LAMP检测空肠弯曲杆菌的灵敏度比常规PCR高100 000倍。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、可视化、低成本、特异性好和灵敏度高等优点,适用于实验室和基层食品安全监管部门进行现场快速检测。

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。

等温扩增技术在水产品寄生虫检测中的应用研究进展

水产品中寄生虫可引起食源性疾病,已成为影响食品安全的重要因素之一。近年来,基于传统分子生物学发展而来的等温扩增技术以其恒温、高效、耗时短、不过度依赖设备和仪器等优点,逐渐应用于分子诊断和疾病检测。该文在介绍等温扩增技术原理与特点的基础上,综述了其在水产品中寄生虫检测方面的应用研究进展,提出存在问题与解决办法,并展望了等温扩增技术的应用前景,以期为快检技术在水产品质量安全控制技术中的研究开发提供理论参考。

环介导等温扩增技术可视化快速检测表皮葡萄球菌方法的建立

目的建立可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,应用于表皮葡萄球菌的快速检测。方法针对表皮葡萄球菌的Ses B基因,选择特异性引物,建立环介导等温扩增体系。对反应的可视化方法、体系中的Mg SO4浓度、甜菜碱浓度、反应温度、反应时间进行优化。将优化好的LAMP反应和PCR反应的灵敏度和特异性进行比较。结果环介导等温扩增反应体系中最适MgSO4终浓度为4mM;最适甜菜碱浓度为0.4M;最适反应温度和时间为63℃,反应60 min;最适宜的可视化方法为钙黄绿素显色法且可视化结果与琼脂糖凝胶电泳结果基本一致;LAMP和PCR反应均具有较好的特异性,LAMP反应的灵敏度为10 copies/μL,PCR反应的灵敏度为100 copiesμL。结论LAMP钙黄绿素可视化检测表皮葡萄球菌感染优于普通PCR,操作简便且不需要昂贵检测设备,有望应用于基层和偏远贫困地区早期诊断。

改良的环介导等温扩增技术在羊布鲁菌病快速诊断中的应用

布鲁菌病严重威胁人类健康和畜牧业生产的常见人畜共患病。建立改良的LAMP,对防控布鲁菌病的传播具有重要意义。选择羊布鲁菌标准菌株DNA保守序列,设计LAMP引物;建立并优化LAMP快速检测体系;通过倍比稀释法等完成灵敏度和特异性实验;选择可疑布鲁菌感染羊血液样本200例,分别进行LAMP、PCR和RBPT检测,完成一致性检验。LAMP反应体系中MgSO_(4)为8 mmol/L,甜菜碱为0.8 mmol/L,钙黄绿素为5 mmol/L,MnCl_(2)为10 mmol/L;布鲁菌均呈现绿色,5种阴性菌株均为橙色;随着模板稀释度的逐渐增大,扩增开始时间逐渐延长,检测极限为10 copies/μL,与凝胶电泳、PCR结果一致;与PCR比较,羊血液标本LAMP阳性率基本一致,无统计学意义(P>0.05);与RBPT比较,LAMP阳性率显著升高,有统计学意义(P<0.05);PCR和LAMP检测一致性较好(Kappa=0.987,P>0.7)。因此,本研究为布鲁菌病提供了特异性好,灵敏度高检测试剂盒。

环介导等温核酸扩增技术快速检测产毒亚历山大藻

DNA环介导等温扩增(LAMP)方法是一种新型的核酸扩增技术,该方法是在等温的条件下进行的,具有反应时间短、灵敏度高、特异性强的特点。本文以产麻痹性贝毒(PSP)的亚历山大藻为研究对象,采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,利用LAMP技术进行产毒藻种的快速检测,同时,着重对LAMP技术与PCR技术在检测微小亚历山大藻细胞的灵敏度方面做了比较。向LAMP终产物中加入SYBRGreenI染料后可直接用肉眼观察结果而不需要通过凝胶电泳来观察。结果表明,LAMP技术在恒温65℃,1h内就可以检测到产毒藻种;LAMP技术检测微小亚历山大藻的最低检测限为200个/ml,而PCR技术的最低检测限为1000个/ml,LAMP扩增方法比PCR扩增方法的程序简单、反应时间短、灵敏度高;LAMP技术不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,可用于野外检测。

基于环介导等温扩增快速检测转基因大豆SHZD32-1成分

转基因大豆SHZD32-1是由我国自主研发的耐除草剂抗性品系。为给该品系转基因生物安全监管提供技术支撑,本研究开发其转基因成分的快速便捷式检测方法,主要基于环介导等温扩增技术,设计并筛选该转化体最佳特异性LAMP引物组,优化扩增温度和时间,并分析灵敏度、特异性及稳定性,建立SHZD32-1的LAMP检测体系。结果显示:在62~64℃条件下反应40~60 min扩增效果最佳;灵敏度标准达到质量分数0.05%,高于普通PCR(0.1%);特异性和稳定性较高,检测结果同普通PCR扩增一致。转基因大豆SHZD32-1成分LAMP技术不需要特殊仪器,检测时间短,结果可视化,灵敏度、特异性和稳定性高,有望用于转基因耐草甘膦大豆SHZD32-1的现场快速检测。

环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157

建立了环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测食源大肠杆菌O157,并对该方法的灵敏度和特异性进行了评价。分别针对大肠杆菌O157三个特异基因rfbE,stx1和stx2的8个独立靶区域设计了外引物、内引物和环引物进行LAMP扩增检测,同时将检测结果与PCR方法做比较。研究结果表明,rfbE,stx1和stx2基因的LAMP方法检测限分别为100,100和10 fg DNA/管,灵敏度是PCR方法的10倍以上;将建立的环介导等温扩增法用于417株食物分离的大肠杆菌的检测,发现LAMP检测rfbE,stx1和stx2基因的灵敏度分别为100%,95.3%和96.3%,对3个靶基因的阴性预测率分别为100%,96.7%和97.1%,特异性和阳性预测率均为100%。结果表明,该方法用于大肠杆菌O157的检测具有特异性强、灵敏度高、操作简便的优越性,在食品安全检测方面具有良好的实际应用前景。

环介导等温扩增技术(LAMP)检测人星状病毒方法的建立及其在再生水检测中的应用

为快速高效地检测人星状病毒,建立了一种新的试验方法——环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification technology,LAMP),并对人星状病毒LAMP反应条件进行了优化。结果表明,镁离子终浓度为4mmol·L-1、甜菜碱终浓度为1mol·L-1的25μL体系下65℃反应90min为其最佳反应条件。对扩增终产物进一步进行酶切分析得到的条带大小与预期的结果(84和135bp)吻合,以人星状病毒、轮状病毒及诺如病毒为模板进行特异性测试亦没有发生交叉反应。将人星状病毒质粒等倍稀释后分别用LAMP及聚合酶链式反应(PCR)检测其灵敏度,结果表明,LAMP与PCR的灵敏度分别达到5.04copies·μL-1和50.4copies·μL-1。用改良的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)及逆转录PCR(RT-PCR)检测12个再生水水样,其中人星状病毒检出率为分别为41.7%(5/12)和33.3%(4/12)。以上结果证明,LAMP是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的检测手段,在人星状病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

传染性造血器官坏死病毒的新型环介导等温扩增(LAMP)荧光检测技术

本研究建立了一种检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的新型荧光环介导等温扩增法,为实验室及现场检测IHNV提供特异性强、灵敏度高、快速、能实时观察扩增荧光信号的检测技术。针对IHNV全基因组序列设计了一组6条LAMP特异性引物,对4株不同来源的IHNV和8株不同的病毒进行特异性实验和灵敏度实验,结果表明该方法具有高度特异性,检测灵敏度可达3.64×10^-7μg/μL,比常规RT-PCR高1000倍,与荧光RT-PCR方法相当。通过环介导等温扩增技术（LAMP）和荧光检测技术相结合,使其检测时间能缩短至15～20分钟内完成检测,并可杜绝由于开盖加染料而导致的假阳性率偏高问题,在鱼病快速检测上具有重要意义。

番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法

目的建立番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法。方法应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对番茄溃疡病菌的16SrRNA特异性基因进行扩增,采用4对引物识别目的片段的6个特异性区域,62℃恒温1h完成扩增。结果设计的引物与对照菌皱纹假单胞菌、茄假单胞菌、丁香假单胞菌番茄致病变种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。这些对照菌在茄科蔬菜上易引起类似症状。结论 LAMP检测程序便捷,所需设备简单,其结果可以通过肉眼观察来判断,比常规PCR灵敏且能更早得到反应结果,因此该技术具有更大的优势。

环介导的等温扩增技术对HBV、HCV和HIV核酸检测的研究

目的建立环介导的等温扩增技术(LAMP)对HBV、HCV和H IV核酸检测的方法并对检测灵敏度和特异性作初步考核。方法通过引物设计和筛选、内质控的设计与时间分辨浊度检测方法的运用,建立LAMP HBVDNA、HCV RNA和H IV RNA扩增体系;用连续稀释的阳性样本和不含任何病毒核酸的正常人血浆考核所建立的LAMP扩增体系的灵敏度和特异性。结果建立了LAMP HBV DNA扩增体系及HCV/H IV RNA双联检体系,该体系对5 CP/m l的HBV DNA样本的检出率为51.85%,对100 CP/m l的HCV RNA阳性样本的检出率为61.90%,对100 CP/m l的H IV RNA阳性样本的检出率为45%。对考核样本检测的相对灵敏度和特异性均为100%。结论LAMP HBV、HCV和H IV检测灵敏度较高,在进一步优化以后能用于HBV、HCV和H IV的核酸检测。

环介导等温扩增结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术快速检测脑膜炎奈瑟菌

目的 建立一种适合现场使用、灵敏、特异的脑膜炎奈瑟菌（N.men）检测方法。 方法 针对N.men的ctrA基因设计环介导等温扩增（LAMP）特异性引物和核酸侵入反应探针，对LAMP扩增产物进行核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针杂交检测。优化反应体系和反应条件后进行敏感性和特异性实验，并与Real-Time PCR检测方法进行比较。 结果 以核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针显色技术检测LAMP扩增产物和毛细管电泳法具有相同的敏感性和特异性；LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术的检测敏感性为10 copies DNA分子/反应，且与其他病原体之间无交叉反应。在临床样本检测方面，LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术与Real-Time PCR检测效果相当。 结论 结合LAMP、核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术建立的N.men检测方法灵敏、特异，无需特殊仪器，适用于基层检测和现场快速检测。

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究Ⅱ

目的为有效地控制预防流行区犬科动物的棘球绦虫感染情况,建立一种快速检测棘球绦虫感染犬的粪便DNA检测方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification.LAMP)。方法针对细粒棘球绦虫线粒体DNA ND2基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内的其它寄生虫DNA来验证LAMP方法的特异性;将转入ND2基因片段的质粒作为标准阳性对照,并做梯度稀释后同时用LAMP和PCR方法进行检测比较两者的敏感性。此外,将采集的46份犬粪便标本提取DNA,分别运用LAMP和犬尸体剖检进行感染犬的初步检测评估。结果 E.g mtDNA ND2基因的LAMP引物能够鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫这两个相近的种属,并不与其它待检寄生虫发生交叉反应,且最低检测限度为4×101拷贝(灵敏度比普通PCR高出103倍)。在初步对46份犬粪便DNA检测结果中ND2LAMP引物显示出较好的灵敏度和特异度,χ2检验结果该方法与犬尸体剖检方法的诊断效果无统计学差异。结论本研究初步建立了LAMP技术检测细粒棘球绦虫感染犬的新方法,在各项特异度、灵敏度和样本检测中展现出较好的效果。该方法不需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳分析过程,有望成为流行区和基层兽医站细粒棘球绦虫感染犬检测的新方法。