应用环介导逆转录等温扩增技术快速检测新城疫病毒

参考新城疫病毒融合基因(fusion gene,F gene)序列,设计了2对能够特异性地识别F基因上的6个区域的引物,并以此建立了一种简单、快速、有效的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法检测NDV.试验结果表明:该方法用时短(2 h内完成)、特异性好而且灵敏度高,最小检测限可达100 pg;对人工发病样品进行鸡胚分离和RT-LAMP检测,二者的阳性符合率高达93.5%;同时采用镁离子沉淀对检测结果进行可视化处理,方便利用肉眼直接观察.

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术，该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物，并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，整个检测反应只需1～2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因，对60份经Real-timePCR或RT—-PCR验证阳性的血清样品检测，阳性符合率为98％。同时，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试，均与预期结果吻合。将Real-timePCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示，该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明，RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段，在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

环介导逆转录等温扩增技术在输血前HCV检测中的应用

目的尝试使用环介导逆转录等温扩增技术用于输血前检测HCV RNA。方法同时采用抗-HCVELISA检测和HCV RT-LAMP检测,比较2者检测结果的差异。结果 2 716例输血前标本,ELISA检测发现19例(0.70%)阳性结果,HCV RT-LAMP检测发现32例(1.18%)阳性结果(P<0.05),2种方法在检测效率上具有显著性差异。RT-LAMP检测在灵敏度上略高于ELISA方法。结论基于HNB颜色反应的环介导逆转录等温扩增技术检测HCV的方法具有快速、灵敏度高的特点。

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。

环介导等温扩增技术在农业病害检测中的应用综述

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸等温扩增技术,其原理是当温度为60~65℃时,DNA处于动态平衡状态,DNA双链打开,此时依赖Bst DNA聚合酶的链置换活性,使DNA可以在60~65℃的恒温下进行合成。其扩增引物是基于靶基因的6个特异性区域设计的,扩增阶段需要引物与样品DNA完全结合,才可以进行扩增,所以LAMP技术具有高特异性与高灵敏性。其反应温度恒定,不需要额外的控温设备,理想条件下仅需保温杯,即可进行DNA扩增。在田间检测时,只需提取样品总DNA,即可于田间进行病害检测,缩短了检测流程及时间,使病害检测更高效更便捷。在反应前或反应后加入特定染色剂,即可通过染色剂的变色情况进行反应结果的判定,使反应结果可视化。目前该技术已凭借其特异性高、灵敏性高、所用仪器简单(恒温水浴锅或保温杯即可)、检测效率高和检测结果可视化等优点,广泛应用于临床病原微生物检测、食品微生物检测、环境微生物检测、植物或微生物基因鉴定等领域。在农业病害的病原微生物(真菌、细菌、病毒、线虫)快速检测和诊断领域,已有很多研究针对各种病害建立了相应的LAMP检测技术。本文简要综述了LAMP技术原理、反应结果判定、优缺点和该技术目前在农业常见病原物检测中的应用,并对LAMP技术的应用前景进行了进一步的展望。

环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。

基于荧光及可视化逆转录环介导等温扩增检测食源性甲型肝炎病毒的方法开发

目的基于荧光及可视化逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)开发食源性甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的检测方法。方法从美国国家生物技术信息中心中选取世界范围内具有代表性的HAV基因信息,设计LAMP引物,开发了一种荧光曲线RT-LAMP和可视化RT-LAMP检测方法。以HAV质粒为模板,评估方法的扩增效率、灵敏度和稳健性,并与实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)进行检出限及实际样品验证比较。结果荧光及可视化LAMP方法检测灵敏度为10.76copies/μL,与实时荧光RT-PCR一致;在95%置信水平下经概率回归分析检出限(limitofdetection,LOD_(95%)),荧光曲线RT-LAMP的LOD_(95%)为17.46copies/μL(7.00~511.29 copies/μL,95%),实时荧光RT-PCR的LOD_(95%)为79.30copies/μL(24.68~3208.71copies/μL,95%);稳健性分析表明方法稳定;与实时荧光RT-PCR比较,检测30份实际样品的验证比对符合率为100%。结论该检测方法经济便捷,可通过肉眼直接观察结果,适合于食品安全现场监测,具有很好的应用前景。

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。

逆转录环介导等温扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用

目的建立逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测诺如病毒的方法。方法采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增诺如克病毒特异性基因,并与RT-PCR方法比较。结果与RT-PCR技术相比,RT-LAMP法更加简便快速,能够在等温条件下进行,特异性好,具有更高的灵敏性。结论RT-LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测诺如病毒快速简便的新方法。

逆转录环介导等温扩增技术检测草莓潜隐环斑病毒的研究

采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了草莓潜隐环斑病毒(Strawberry latent ringspot virus,SLRSV)检测方法。根据SLRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过逆转录环介导等温扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对SLRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP的灵敏度比普通RT-PCR高出100倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中65℃等温扩增,整个检测周期约1.5h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。

逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。

小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立

目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。

环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。

改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。

荧光定量环介导逆转录等温扩增技术检测丙型肝炎病毒反应体系的建立

目的建立一种快速、灵敏、特异性高的方法定量检测丙型肝炎病毒RNA。方法根据丙型肝炎病毒基因5’UTR序列中8个基因区段设计3对特异引物同时加入SYBRGreenⅠ染料在反转录酶和BstDNA聚合酶的作用下60℃等温条件下扩增1h后根据荧光曲线进行定量。结果120例经实时荧光定量PCR检测阳性的血清样品进行检测阳性符合率100％。110例健康体检者的血清经两种方法检测均阴性。对卫生部临检中心提供10’IU／ml的质控样本采用阴性血清稀释后进行灵敏度的实验，结果显示荧光定量环介导逆转录等温扩增（RT—LAMP）技术可检出10IU／ml浓度的RNA分子颗粒。结论成功建立了荧光定量环介导逆转录等温扩增技术检测丙型肝炎病毒的方法。恢技术具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P>0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。

应用逆转录环介导等温扩增技术检测大豆种子中烟草环斑病毒

根据烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白基因序列设计并合成了1组RT-LAMP引物,利用实时浊度仪监测反应过程,初步建立了烟草环斑病毒的RT-LAMP检测方法,并进行了特异性与灵敏度检测。结果显示,RT-LAMP灵敏度与普通RT-PCR法相当,但检测时间明显缩短,1 h即可完成反应。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可通过裸眼观察荧光的有无来判断是否有扩增。对大豆种子中携带的烟草环斑病毒进行了RT-LAMP检测,裸眼判定与仪器监测结果一致。结果证明所建立的TRSV RT-LAMP方法具有快速、特异、灵敏,操作简单的特点,不需复杂仪器设备,适合于TRSV的现场快速检测。

基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增技术检测柯萨奇病毒A6型

目的建立基于羟基萘酚蓝（hydroxynaphtholblue，HNB）颜色变化的简单、灵敏和快速的环介导逆转录等温扩增技术（RT—LAMP）检测方法，应用于柯萨奇病毒A6型（coxsackievirusA6，CV-A6）的检测。方法针对CV-A6的VPl基因设计6条特异引物，在等温条件下（63℃）进行50min扩增反应。扩增前在反应体系中加入HNB，通过观察颜色变化进行检测结果判定。使用多种肠道病毒进行特异性验证，使用梯度稀释的体外转录CV-A6全VP1基因RNA进行灵敏度分析，同时与实时荧光定量逆转录PCR（rRT—PCR）检测结果进行比较，并对92份手足口病患者临床标本进行检测。结果本研究建立的RT-LAMP方法对除CV-A6外的23种肠道病毒的检测结果均为阴性，灵敏度为100拷贝／反应，与rRT—PCR方法相当。在对92份手足口病临床标本的检测中，检测结果与rRT-PCR方法相符，Kappa值为1，灵敏度和特异性均为100％。结论本研究建立的针对CV-A6的LAMP检测方法，特异度高，灵敏度与rRT—PCR相当，有望应用于CV—A6感染的快速筛选，具有在基层医疗卫生机构和现场推广与应用的潜力。

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察。整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应。本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术。

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。