利用环媒恒温基因扩增法检测生猪刚地弓形虫

基于已公布的刚地弓形虫Sag2基因序列设计了1套特异引物,经过条件优化,成功建立了针对刚地弓形虫(简称弓形虫)的环媒恒温基因扩增检测法.根据扩增弓形虫和其他几种病原生物的效果对该方法进行评估.结果表明,该方法只检出致病性弓形虫,特异性良好;检测最低速殖子浓度为4个/μL.对长沙、株洲、湘潭三地生猪血样检测的结果是仔猪、成猪和种母猪弓形虫感染率分别为6.45%、7.69%和15.38%.

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23S rRNA基因部分序列设计1套(共4条)能够识别6个区域的特异性引物;优化扩增条件;评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法,成功地建立了环媒恒温基因扩增(LAMP)检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。

环介导恒温扩增技术在轮状病毒基因检测中的应用

目的建立环介导恒温扩增技术快速检测轮状病毒的方法。方法采用环介导恒温扩增反应(LAMP)技术扩增轮状病毒特异性基因,并与传统PCR技术检测结果比较。结果 LAMP法更加简便快速、且在恒温条件下进行,特异性好,且具有更高的灵敏性。结论 LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测轮状病毒提供了快速简便的新方法 。

环媒恒温扩增（LAMP）技术在寄生虫检测中的应用

环媒恒温扩增（Loop—mediatedisothermalamplification，LAMP）技术是一种快速、简单、敏感、特异的核酸扩增方法。作为一种新的核酸扩增方法，LAMP法被逐渐应用于寄生虫、病毒、微生物的检测，是最有发展前景的快速诊断方法之一，本文就LAMP技术在寄生虫检测方面的应用发展情况进行综述。

环媒恒温扩增技术及其在疫病检测中的应用

介绍环媒恒温扩增技术的基本原理、特点及其在疫病检测和诊断中的应用情况。环媒恒温扩增技术具有简便、快速、特异性和灵敏性强、扩增效率高等特点,被广泛应用于各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病等很多方面的研究与检测。

内引物在环媒恒温基因扩增技术中的作用研究

目的研究内引物在环媒恒温基因扩增(LAMP)中的作用,确定利用LAMP的同一套特异性引物区别具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌基因的可行性。方法采用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变,使其T669→A669、T725→A725,用原LAMP特异性引物扩增含单核苷酸差异序列,观察扩增结果。结果制备的点突变模板C大小与预期值(1 371 bp)一致。LAMP扩增的伤寒沙门氏菌CMCC50098标准株DNA产物的电泳条带呈梯状,而扩增模板C未扩出反应产物。结论LAMP不能利用同一套引物扩增具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌,即可利用同一套引物区分这些病原菌。

环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,其快速检测具有重要意义。根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,设计一套引物,通过条件优化,成功建立了针对致病性溶藻弧菌的环介导恒温扩增检测技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。应用LAMP技术,在65℃温育1h的条件下扩增溶藻弧菌基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带。该研究建立的LAMP法特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于n(cell)=38/mL的菌液浓度,灵敏度更高。综合分析表明,LAMP技术是快速、简易、实地诊断溶藻弧菌的理想工具。

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。

基于颜色判定的环介导恒温扩增技术快速检测铜绿假单胞菌的研究

目的建立了一种基于颜色判定的,能够快速准确地检测铜绿假单胞菌的LAMP方法。方法针对铜绿假单胞菌OprL基因设计3对LAMP引物,通过引物特异性识别OprL的8个独立区域来快速检测铜绿假单胞菌。如果在反应前添加荧光染料羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein),其结果可以通过肉眼观察反应前后颜色变化来判定并经琼脂糖凝胶电泳验证。对该技术进行特异性、灵敏度分析,利用LAMP和PCR同时检测临床标本。结果设计出针对铜绿假单胞菌OprL基因的恒温扩增检测方法。本恒温扩增检测法只扩增铜绿假单胞菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性。其最低检测限为17.414 pg/μl,PCR方法最低检出限为174.414 pg/μl,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,灵敏度高。LAMP法对临床阳性标本检出率与PCR法相当(27/27)。结论 LAMP方法用于快速检测铜绿假单胞菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断。

食品和饲料中转基因植物FMV35S启动子环介导等温扩增检测方法的建立

[目的]建立FMV35S基因启动子环介导等温扩增的检测方法。[方法]建立一种检测食品和饲料中FMV35S转基因成分的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,并利用实时浊度法对该LAMP检测方法进行灵敏度、特异性和稳定性评价。[结果]该方法的检测限为0.5%,特异性和稳定性良好。采用LAMP法与荧光PCR方法进行了实际样品对比检测,结果一致可靠。[结论]可采用LAMP法对食品和饲料中FMV35S转基因成分进行检测。

环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌广泛分布于海水或海产品中,人类摄入或接触污染的水源和食物易引起感染。近年来,有关致病性弧菌引起腹泻的报道逐渐增多,但GB标准的细菌学诊断方法检测周期长达1周左右,而且操作较为复杂,难以满足控制疾病暴发和传播的需要,就这一现状,建立了一套不仅快速、准确,而且操作简便、不依赖昂贵仪器的检测方法,应用于海产品中副溶血弧菌快速检测。采用环介导恒温扩增方法(LAMP),针对副溶血弧菌的gyrB基因设计特异引物,进行恒温扩增。使用该方法最低检出限达到101CFU/mL,灵敏度可以达到0.1pg副溶血弧菌基因组DNA,为海产品中副溶血弧菌的检测提供了一个新的辅助方法。

环介导恒温扩增芯片法在机械通气患者下呼吸道病原体检测中的应用

目的探究环介导恒温扩增芯片法在机械通气患者下呼吸道病原体检测中的应用。方法收集2021年1月至6月90例新转入河北医科大学第一医院呼吸内科及重症监护室行经气管插管机械通气合并通气后下呼吸道感染患者肺泡灌洗液标本,行细菌培养及药敏鉴定,同时采用环介导恒温扩增芯片法进行病原菌核酸检测,对检测到病原菌的标本进行耐药基因芯片检测,分析患者病原体及耐药基因检出情况。结果共检测标本90例,环介导恒温扩增芯片法检测阳性标本69例,标本阳性率为76.67%,细菌培养标本阳性31例,标本阳性率为34.44%,环介导恒温扩增芯片法阳性检出率明显高于细菌培养法;对阳性菌株进行耐药实验,以每个样本为单独整体,环介导恒温扩增芯片法在mecA、OXA-48、OXA-23等耐药基因的检测上具有较高检出率,且与耐药检测“金标准”符合率高。结论环介导恒温扩增芯片法病原体及耐药基因检出率均高于传统细菌培养及药敏试验,且其耐药基因检测符合率高,用于指导临床用药具有良好的应用前景。

转Bt基因作物恒温扩增快速检测技术

[目的]建立一种快速检测转Bt基因作物的方法。[方法]利用Bt的Cry1ab/ac基因序列设计特异性引物,建立LAMP检测方法以及优化反应体系,并进行LAMP的特异性和灵敏度试验。[结果]成功建立转Bt基因作物的LAMP检测方法,得到最优的反应体系。在特异性试验中,转Bt基因作物基因组DNA均呈阳性,而非转基因作物、转Bar基因作物、转CPTI基因作物、转EPSPS基因作物等均为阴性;在灵敏度试验中,转Bt基因作物的最低检测限为10个拷贝。[结论]LAMP方法具有很高的特异性和灵敏度,可用于转Bt基因作物的现场快速检测。

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。

环介导恒温扩增法快速检测短小芽孢杆菌

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是一种能引起食源性疾病的腐败菌,对其进行快速检测具有重要意义。针对短小芽孢杆菌木聚糖(xynA)基因,设计了4条特异性引物(两条内引物和两条外引物),通过条件优化,首次将一种新颖的核酸扩增技术——环介导恒温扩增技术应用于短小芽孢杆菌的快速检测。采用该技术,63℃温育1h的条件下扩增短小芽孢杆菌DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带。PCR和LAMP的检测灵敏度分别约为162和16.2拷贝每反应。结果表明,该方法检测短小芽孢杆菌特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低,1h即可完成,有望发展成为快速检测短小芽孢杆菌的有效手段。

志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测志贺氏菌属的方法,本研究针对其ipaH基因,建立了志贺氏菌属环介导恒温护增(LAMP)快速检测方法。利用该方法对50株细菌进行检测,结果显示7株志贺氏菌均为阳性,其它菌均为阴性,表明该方法具有高度特异性。灵敏度试验显示,对志贺氏菌纯培养菌的检测灵敏度为28cfu/mL,对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35cfu/mL。利用该方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测,共检出29份阳性样品,与细菌分离鉴定检测结果一致。该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。

食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒、组织及器官的化脓性炎症,建立快速、准确的检测方法对预防和控制金黄色葡萄球菌的传染具有重要意义。【方法】DNA环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的快速、高灵敏核酸扩增技术,本研究利用该技术建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。基于金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因序列,设计4条特异性LAMP扩增引物,两条外引物F3和B3及两条内引物FIP和BIP,在BstDNAPolymerase作用下,65℃恒温水浴中,对26个种类共45株细菌进行扩增,所试的20株金黄色葡萄球菌均为LAMP阳性,说明所设计的LAMP引物具有高度特异性。【结果】本LAMP方法对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度为25CFU/mL,对污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42CFU/g,40—60min内即可完成检测。检验检疫实践证明,利用本LAMP方法对958份肉类、蛋奶及其制品、人工污染样品等进行检测,检出115份LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。【结论】本LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。

基于环介导等温扩增技术水产品中副溶血弧菌快速检测方法的建立与应用

本试验基于环介导等温扩增(LAMP)技术,以副溶血弧菌toxR基因为靶基因,设计两对LAMP引物F3/B3和FIP/BIP,建立了副溶血弧菌LAMP检测方法,60min内即可完成检测。该LAMP方法特异性强、灵敏度高,对纯培养副溶血弧菌的检测灵敏度为42CFU/mL,对污染食品中副溶血弧菌的检测灵敏度为67CFU/mL。实践应用证明,本试验建立的副溶血弧菌LAMP检测方法操作简单、检测结果准确,具有良好的实用性。

食品中单增李斯特菌环介导等温扩增检测技术

目的:建立一种快速、简单地检测食品中单增李斯特菌的环介导恒温基因扩增方法(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP),并初步建立荧光定量LAMP检测单增李斯特菌的方法。方法:根据LAMP方法的原理,设计LAMP检测引物,建立LAMP检测方法,同时对方法的特异性、灵敏度、重复性及初始拷贝数的对数值与反应时间之间的线性关系进行评估。结果:使用LAMP引物可以在0.5h内完成检测工作;LAMP检测技术的灵敏度高出聚合酶链式反应检测技术100倍以上,检出限达到1.72×101拷贝/反应,与其他食源性致病菌无交叉反应,平均实验间变异系数小于5%;反应时间与初始模板浓度的常用对数值有良好的线性关系(R2=0.9994)。结论:本方法具有快速、灵敏、特异、操作简单、设备要求低的特点,具有广阔的应用前景。