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加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究 被引量:5
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作者 李雪 唐善虎 +1 位作者 郝小倩 岑璐伽 《西南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 2012年第1期64-68,共5页
探讨了加环引物对LAMP的影响,并与普通PCR法进行了比较,建立一套快速检测沙门氏菌的新方法.以沙门氏菌的inva基因为靶基因,选择PCR的特异性引物,并基于该基因设计出LAMP反应的引物;该研究对LAMP体系的反应温度、dNTP浓度和镁离子浓度等... 探讨了加环引物对LAMP的影响,并与普通PCR法进行了比较,建立一套快速检测沙门氏菌的新方法.以沙门氏菌的inva基因为靶基因,选择PCR的特异性引物,并基于该基因设计出LAMP反应的引物;该研究对LAMP体系的反应温度、dNTP浓度和镁离子浓度等扩增条件也进行了优化,并检测了PCR和LAMP的引物特异性,比较了PCR法、LAMP法和加环引物的LAMP法的灵敏度.结果表明:普通PCR法检测的灵敏度为2.28×103cfu/ml,未加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×101cfu/ml,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×100cfu/ml.通过三种方法的比较可知:LAMP法检测沙门氏菌比PCR法更加快速、灵敏,而加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率.本研究为快速检测沙门氏菌方法的构建奠定了基础,并认为LAMP在检测微生物方面有着广泛的发展前景. 展开更多
关键词 介导等温扩增 环引物 沙门氏菌
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加环引物LAMP法快速检测布鲁氏杆菌方法的研究 被引量:1
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作者 郭恋 蒙晓雷 +4 位作者 李秀梅 李颖 杨爱华 王健春 赵静 《上海畜牧兽医通讯》 2015年第2期2-4,共3页
研究以布鲁氏杆菌保守的OMP25蛋白基因为靶基因,设计了6条LAMP特异性引物,同时探讨了加环引物对LAMP的影响,通过优化LAMP体系的反应条件,建立了一套快速检测布鲁氏杆菌的新方法。LAMP扩增产物可通过凝胶电泳和荧光显色进行判定。该研究... 研究以布鲁氏杆菌保守的OMP25蛋白基因为靶基因,设计了6条LAMP特异性引物,同时探讨了加环引物对LAMP的影响,通过优化LAMP体系的反应条件,建立了一套快速检测布鲁氏杆菌的新方法。LAMP扩增产物可通过凝胶电泳和荧光显色进行判定。该研究比较了LAMP法和加环引物LAMP法的灵敏度,并检测了其引物特异性。试验结果显示,普通LAMP法的灵敏度为20CFU/mL,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.0CFU/mL。通过两种方法的比较可知:LAMP法可以快速、直观、准确地检测布鲁氏杆菌,加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率,是一种在基层现场有广泛应用前景的检测方法。 展开更多
关键词 布鲁氏杆菌 介导等温扩增 环引物 OMP25基因
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生殖道病原菌LAMP检测的环引物设计与优化
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作者 贾义国 徐小芳 +3 位作者 陈尚贤 王新博 余跃 孙群 《中国测试》 CAS 北大核心 2023年第11期60-67,共8页
孕期生殖道病原菌感染是威胁妇女和胎儿健康的常见疾病之一,为改进现有检测方法耗时长的缺陷,对基于环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)的生殖道病原菌快速检测方法进行优化。在Gardnerella vaginalis的LAMP... 孕期生殖道病原菌感染是威胁妇女和胎儿健康的常见疾病之一,为改进现有检测方法耗时长的缺陷,对基于环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)的生殖道病原菌快速检测方法进行优化。在Gardnerella vaginalis的LAMP检测体系中,通过对不同环引物组扩增速率(Ct值)进行统计学分析,验证了环引物在LAMP反应中提升扩增速率的能力,同时探究了环引物长度和GC含量对扩增速率的影响,并将其作为环引物筛选参数应用于3种生殖道病原菌(G.vaginalis、Streptococcus agalactiae、Enterococcus faecalis)检测的环引物设计。结果表明,不同GC含量的环引物扩增速率差异不显著,而环引物的长度是影响其扩增效果的关键因素,碱基数较少的环引物有利于提高LAMP反应速率(p<0.05),设计出的引物组GV-1、GBS-132和EF-3可以在105 CFU/mL扩增浓度下在30 min内呈现完整“S”扩增曲线,具有较好的临床病原菌筛查应用潜力。 展开更多
关键词 病原菌检测 环引物 介导等温扩增 生殖道感染 快速检测
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改进茎环引物RT-PCR法实时定量检测microRNA 被引量:3
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作者 薛慧慧 马骁骁 +3 位作者 朱长保 晁天柱 肖君华 周宇荀 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第28期5431-5435,共5页
目的:为检测不同组织中microRNA(miRNA)的表达量,本研究建立了一种改进的qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)技术。方法:采用具有高特异性的茎环引物逆转录,结合SYBR Green实时定量PCR技术,建立了以延伸茎环引物RT-PCR为... 目的:为检测不同组织中microRNA(miRNA)的表达量,本研究建立了一种改进的qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)技术。方法:采用具有高特异性的茎环引物逆转录,结合SYBR Green实时定量PCR技术,建立了以延伸茎环引物RT-PCR为基础的实时定量检测microRNA的方法。结果:本研究建立的microRNA检测方法,特异性好,灵敏度高,线性范围宽。熔解曲线的单一峰型和电泳检测到的单一条带都证明了扩增的特异性。对标准品的检测跨越了7个数量级的浓度范围,最低拷贝数为103,效率高达98%。结论:利用该技术检测了120个组织样本,说明该方法可快速、准确、高效的获取不同组织中miRNA的表达量,为进一步探讨miRNA对性发育的影响提供了实验依据。 展开更多
关键词 MIRNA RT-PCR 环引物 引物延伸
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茎环引物实时定量PCR技术用于检测异核苷修饰的siRNA的可行性研究 被引量:1
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作者 王雨斯 马元 +2 位作者 刘欣洁 张礼和 杨振军 《中国科学:化学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期710-718,共9页
本文考察了茎环引物实时定量PCR技术用于定量检测D-/L-异核苷(D-/L-iso NA)修饰的siRNA的可行性.根据阈值循环数(Ct值)及异核苷修饰的siRNA模板的初始浓度的对数值(lgC)绘制了标准曲线,与siRNA的标准曲线进行对比,发现D-异尿苷(D-isodU... 本文考察了茎环引物实时定量PCR技术用于定量检测D-/L-异核苷(D-/L-iso NA)修饰的siRNA的可行性.根据阈值循环数(Ct值)及异核苷修饰的siRNA模板的初始浓度的对数值(lgC)绘制了标准曲线,与siRNA的标准曲线进行对比,发现D-异尿苷(D-isodU)修饰的siRNA(D-isodU-siRNA)不影响茎环引物实时定量PCR过程,而L-isodU修饰的siRNA(L-isodU-siRNA)降低了逆转录效率,而使测得的Ct值偏高,且对逆转录效率的影响有浓度依赖性和修饰位点特异性.因此,对前者既可进行绝对定量也可进行相对定量,对于后者只能进行绝对定量.将上述方法应用于isodU-siRNA血清稳定性的检测,获得了更可靠的定量结果.运用双标准曲线法,可进行胞内isodU-siRNA的定量检测. 展开更多
关键词 环引物实时定量PCR 异核苷 绝对定量 双标准曲线法
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特异性逆转录microRNA-505的高效茎环引物的设计
6
作者 熊黎 仝莉 +3 位作者 王茂春 周宇荀 李凯 肖君华 《现代生物医学进展》 CAS 2015年第27期5225-5229,共5页
目的:构建一个高效且特异性的逆转录茎环引物,以准确定量检测小鼠的mi RNA-505基因,同时探讨茎环引物的结构对逆转录效率的影响。方法:规律性地改变通用茎环引物的茎部和环部的碱基结构,再进行不同的组合,利用逆转录-聚合酶链式反应(Rev... 目的:构建一个高效且特异性的逆转录茎环引物,以准确定量检测小鼠的mi RNA-505基因,同时探讨茎环引物的结构对逆转录效率的影响。方法:规律性地改变通用茎环引物的茎部和环部的碱基结构,再进行不同的组合,利用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术,探寻效率最高的茎环引物。结果:当固定茎部结构为14对碱基,规律性改变环部碱基个数(15,18,21),经RT-PCR检测的CT值无差异,均为28.5;当固定环部结构为21个碱基,CT值随茎部碱基对(8,11,14)规律性地延长而逐渐增大;当环部结构为21个碱基,茎部结构为8对碱基时CT值最小,为26.7。结论:环部结构对茎环引物的效率无贡献;当环部结构为21个碱基,茎部结构为8对碱基时,茎环引物的效率和特异性是最佳的,适用于准确检测小家鼠的mi RNA-505基因。 展开更多
关键词 环引物 MI R-505 逆转录 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
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快速检测HPV16的环介导等温扩增检测法的建立
7
作者 苏华 陈琛 +1 位作者 李亚偶 张玉红 《西南国防医药》 CAS 2017年第2期109-111,共3页
目的建立快速检测人乳头瘤病毒16(HPV16)的环介导等温扩增法(LAMP)法。方法针对HPV16 E7区设计LAMP引物,建立LAMP反应体系,对其检测敏感度进行了验证,并与PCR法、LAMP加环引物法、LAMP试剂盒法进行了比较结果利用LAMP方法能成功检测到HP... 目的建立快速检测人乳头瘤病毒16(HPV16)的环介导等温扩增法(LAMP)法。方法针对HPV16 E7区设计LAMP引物,建立LAMP反应体系,对其检测敏感度进行了验证,并与PCR法、LAMP加环引物法、LAMP试剂盒法进行了比较结果利用LAMP方法能成功检测到HPV16病毒E7区的基因,等温条件下反应60 min即可较好完成检测;加入环引物的LAMP法敏感度高于PCR法,与LAMP试剂盒法敏感度一致,为103稀释倍数。结论 LAMP方法具有灵敏度高,操作简便快捷,无需复杂特殊仪器的优点,适用于HPV16病毒的快速检测,具有很好的开发应用前景。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16 环引物 介导等温扩增法 检测
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环介导等温扩增方法在生物检测方面的研究进展 被引量:3
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作者 施伟 赵凯 +2 位作者 唐雪明 韩芳婷 许燕 《江西农业学报》 CAS 2011年第12期150-154,共5页
综述了环介导等温扩增(LAMP)技术的原理、引物设计、方法创新、应用、技术特点等,并指出了LAMP技术的优点及可能存在的问题。
关键词 介导等温扩增 环引物 原理 生物检测 应用
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微小RNA及其表达水平检测方法的研究进展 被引量:10
9
作者 李莉 温旺荣 朱晴晖 《检验医学》 CAS 北大核心 2009年第4期316-320,共5页
关键词 微小RNA 环引物 逆转录 聚合酶链反应
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基于实时荧光定量反转录PCR技术的动物miRNA表达分析策略 被引量:3
10
作者 宋嘉哲 孙福伯 +1 位作者 庄开歌 薛恺 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第9期109-113,共5页
在人体内有约60%的蛋白质编码基因受到到miRNA调控。近年来,miRNA参与调控的与动物生长相关的细胞周期、发育、分化和新陈代谢等多种生物学过程也越来越受到关注。目前针对miRNA表达检测的常用方法有很多,其中基于反转录PCR(RT-PCR)的... 在人体内有约60%的蛋白质编码基因受到到miRNA调控。近年来,miRNA参与调控的与动物生长相关的细胞周期、发育、分化和新陈代谢等多种生物学过程也越来越受到关注。目前针对miRNA表达检测的常用方法有很多,其中基于反转录PCR(RT-PCR)的放大检测技术是应用范围最广,实施手段最灵活的一种研究策略。主要包括miRNA的全定量PCR法(miR-Q)、基于茎环引物的实时荧光定量PCR法、Poly(A)加尾性通用反转录法、miRNA表达谱的高通量RT-PCR分析和miRNA扩增谱系(mRAP)法。作者对这几种基于实时荧光定量RT-PCR技术的动物miRNA表达分析策略分别进行了介绍,对其原理、方法和应用范畴进行了概括性总结。 展开更多
关键词 动物miRNA 实时荧光定量PCR miRNA的全定量PCR 茎-环引物 miRNA扩增谱系
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两种实时定量RT-PCR方法检测miRNAs表达的技术分析 被引量:6
11
作者 闵自信 杜小云 +5 位作者 宁启兰 钟楠楠 郑悦雯 韩燕 吕社民 张蕊 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期258-262,共5页
目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取... 目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取rno-miR-15b、rno-miR-16、rno-miR-195、rno-miR-497作为研究对象,分别用茎环引物和试剂公司提供的试剂盒方法反转录总RNA,并应用实时定量PCR方法检测这些miRNAs的表达量。提取人血浆中总RNA,用上述两种RT-qPCR方法实时定量检测has-miR-16的表达量。结果两种方法检测这些miRNAs表达量,在大鼠21d和42d这两个时间点其表达量变化趋势相同,都呈现增高的趋势,这与我们前期Solexa测序结果相同。在血浆中的结果显示,其中茎环引物反转录方法灵敏度相对较高。结论茎环引物法在少量几个重要的miRNAs检测中具有优势,而试剂盒方法适用于大量miRNAs的筛查。 展开更多
关键词 MIRNAS 环引物 实时定量反转录聚合酶链反应 软骨 血浆
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棉花miRNA表达量检测方法Stem-loop RT-PCR的建立 被引量:2
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作者 胡广 王乐 +4 位作者 张振楠 唐叶 周璐璐 彭清忠 吴家和 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期2121-2127,共7页
为建立一套鉴定棉花miRNA表达丰度的分子技术,优化了Stem-loop RT-PCR方法,并通过分析棉花3个miRNA的表达谱来评价分析该技术体系的特性。首先设计3条引物(茎环特异性反转录引物、正向引物和通用反向引物),通过cDNA和RNA梯度稀释,分析... 为建立一套鉴定棉花miRNA表达丰度的分子技术,优化了Stem-loop RT-PCR方法,并通过分析棉花3个miRNA的表达谱来评价分析该技术体系的特性。首先设计3条引物(茎环特异性反转录引物、正向引物和通用反向引物),通过cDNA和RNA梯度稀释,分析引物的扩增效率和检测灵敏度。结果表明,Stem-loop RT-PCR方法中设计的引物具有较高的扩增效率和检测灵敏度,miR156和miR159扩增效率分别为102.0%和103.6%;并对不同miRNA分析其总RNA检测灵敏度,miR156和miR159的总RNA检测灵敏度差异较大,分别为20 ng和2 pg。同时,应用建立的棉花Stem-loop RT-PCR方法,成功地分析了Gh-miR156、Gh-miR159和Gh-miR5658在根茎叶中的表达量。由此可见,棉花Stem-loop RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、成本较低和适用于一般实验室等优点,为棉花等植物miRNA相关研究提供了技术保证,加快了miRNA及其调控基因功能的研究步伐。 展开更多
关键词 STEM-LOOP RT-PCR 棉花 MIRNA 环引物
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猪圆环病毒2型湖南分离株HNLYYA1全基因组的多引物滚环扩增和序列分析 被引量:3
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作者 王占锋 朱哲 +4 位作者 湛洋 邓治邦 王爱兵 杨毅 王乃东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期454-460,共7页
首先采用常规PCR法对7份湖南省某地区猪病料进行猪圆环病毒2型(PCV2)的检测,然后对1份PCV2阳性病料的总DNA进行多引物滚环扩增(MPRCA)反应,最后利用限制性内切酶(Eco RⅠ和NcoⅠ)酶切MPRCA产物。结果显示,酶切后的MPRCA产物条带与PCV2... 首先采用常规PCR法对7份湖南省某地区猪病料进行猪圆环病毒2型(PCV2)的检测,然后对1份PCV2阳性病料的总DNA进行多引物滚环扩增(MPRCA)反应,最后利用限制性内切酶(Eco RⅠ和NcoⅠ)酶切MPRCA产物。结果显示,酶切后的MPRCA产物条带与PCV2基因组或片段的大小一致。将回收的目的条带与Psp72载体连接,转化DH5α菌,最后对提取的重组质粒进行测序和序列比对。获得的PCV2分离株HNLYYA1提交于Gen Bank(登录号KJ867555),其全基因组大小为1 767 bp,基因型为PCV2b-1C。该株PCV2 Cap蛋白与其他毒株进行比对,发现其具有独特的氨基酸突变,NLS区34位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)、LOOP GH区169位精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)、LOOP HI区206位赖氨酸(K)突变为异亮氨酸(I)。本研究揭示了湖南PCV2分离株HNLYYA1的全基因组特征,并为环状病毒的全基因组分离研究提供新的技术途径。 展开更多
关键词 猪圆病毒2型 湖南株 引物扩增 PCV2b
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Rapid,sensitive detection of Vibrio anguillarum using loop-mediated isothermal amplification 被引量:2
14
作者 高宏伟 李富花 +2 位作者 张晓军 王兵 相建海 《Chinese Journal of Oceanology and Limnology》 SCIE CAS CSCD 2010年第1期62-66,共5页
Vibrio anguillarum is an important bacterial pathogen of aquatic organisms and a significant problem in aquatic farming. The rapid detection and identification of V. anguillarum, and other pathogens that infect marine... Vibrio anguillarum is an important bacterial pathogen of aquatic organisms and a significant problem in aquatic farming. The rapid detection and identification of V. anguillarum, and other pathogens that infect marine organisms, is crucial to effective disease management. In this study, we developed a loop-mediated amplification (LAMP) assay to detect V. anguillarum in an hour in a single tube without the need for thermal cycling. Conserved regions of the metalloproteinase (empA) gene of V. anguillarum served as the targets for primer design. A fragment of the empA gene was amplified at 65℃ in the presence of the primer mixture and Bst DNA polymerase. In the optimized LAMP assay, 6.7 pg of V. anguillarum DNA could be detected. Six strains of V. anguillarum and 17 strains of non-V, anguillarum bacteria were used in this study to evaluate the species specificity of the primers. The six V. anguillarum strains gave a positive result in the LAMP assay. This method was also validated in V. anguillarum-infected fish. This LAMP method is more sensitive than PCR in the detection of V. anguillarum and shows good species specificity. The LAMP assay is therefore an effective method for the quick detection of V. anguillarum both in the laboratory and in the field. 展开更多
关键词 Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) detection assay empA gene Vibrio anguillarum
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Biphenyl Bis [π-cyclopentadienyl ) iron] Dication as an Efficient Cationic Photoinitiator for Epoxy Polymerization
15
作者 王涛 张影 任晓玲 《Chinese Journal of Chemical Engineering》 SCIE EI CAS CSCD 2008年第5期819-822,共4页
Ferrocenium monocations as photoinitiators for cationic photopolymerization suffer from a limitation of low absorption and low reactivity under high-pressure Hg lamp. Here, a ferrocenium dication salt, biphenyl bis [... Ferrocenium monocations as photoinitiators for cationic photopolymerization suffer from a limitation of low absorption and low reactivity under high-pressure Hg lamp. Here, a ferrocenium dication salt, biphenyl bis [π-cyclopentadienyl)iron] hexafluorophosphate ([bis(Cp-Fe)-biphenyl] (PF6)2 was synthesized by the ligand exchange reaction between ferrocene and biphenyl. The chemical structure was characterized with FTIR and ^1HNMR. The separation of ferrocenium monocation cyclopentadien-iron-biphenyl hexafluorophosphate ([Cp-Fe-biphenyl] PF6) and dication [bis(Cp-Fe)-biphenyl] (PF6)2 was carried out by column chromatography. The photoactivity of initiating photopolyinerization of epoxide ER14221 was studied as a cationic photoinitiator. [Bis(Cp-Fe)-biphenyl] (PF6)2 can efficiently absorb radiation above 300nm and its photoactivity is higher than that of its monocation. 展开更多
关键词 cationic photopolymerization [bis(Cp-Fe)-biphenyl] (PF6)2 PHOTOINITIATOR PHOTOACTIVITY
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环介导等温扩增技术改进及在动物病原检测中的应用 被引量:7
16
作者 陈秋慧 李政志 +7 位作者 张海艳 严蕊 杨晶涵 陈洁 陈曦 陈颖钰 郭爱珍 胡长敏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期633-639,共7页
环介导等温扩增(LAMP)技术是一种能在恒温设备下对靶基因进行扩增的技术,具有精确、快速、简单及低成本的优点,已广泛应用于食品安全、医疗卫生及农业现场检测等多个领域。本文主要从环介导等温技术的原理、反应体系改进、产物检测方法... 环介导等温扩增(LAMP)技术是一种能在恒温设备下对靶基因进行扩增的技术,具有精确、快速、简单及低成本的优点,已广泛应用于食品安全、医疗卫生及农业现场检测等多个领域。本文主要从环介导等温技术的原理、反应体系改进、产物检测方法的改进、LAMP与其他技术的联用,以及目前LAMP在动物病原检测方面的应用进行了分析,并展望了LAMP技术的应用前景,以期为同仁提供参考。 展开更多
关键词 介导等温扩增 环引物 Bst DNA聚合酶 LAMP体系 动物病原检测
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茎环法RT-qPCR定量检测细胞抗猪瘟病毒siRNA的表达 被引量:3
17
作者 刘帅 李江南 +3 位作者 袁婷 杨凡力 逄大欣 涂长春 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期26-36,共11页
RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高... RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8),成功地建立了最优的siN1和siN2的茎环法RT-qPCR检测方法。该方法表现出良好的特异性和较高的灵敏度,能检测出102至108个拷贝的siRNA,至少可达7个数量级的检测范围,平行性好(Rsq=0.999),扩增效率高(Eff.=98.2%)。茎环法RT-qPCR能准确地定量检测抗CSFV的PK-15细胞克隆的siN1/siN2表达水平,可结合常规的检测病毒水平的间接免疫荧光和TCID50等技术定量评价RNAi抗CSFV的有效性,为未来抗猪瘟转基因猪的抗病毒效果评价提供了先进的检测技术。 展开更多
关键词 抗猪瘟病毒小干扰RNA 环引物 MGB探针 实时定量PCR
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