p62体募集自噬相关蛋白WIPI2的机制研究

目的探讨自噬接头蛋白(Sequestosome 1,SQSTM1/p62)与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)复合物的结合蛋白WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)在空间上定位的调控关系。方法使用CRISPR-Cas9技术敲除正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney,NRK)中的自噬相关基因2A(Autophagy-related gene,Atg2A)、自噬相关基因2B(Autophagy-related gene,Atg2B)和p62基因,建立Atg2A和Atg2B基因敲除的细胞系(Atg2AB double knockout,Atg2AB DKO)以及p62基因敲除细胞系(p62 knockout,p62 KO);透射电镜观察Atg2AB DKO细胞中p62体周围囊泡的定位;活细胞成像观察Atg2AB DKO细胞内p62体与自噬相关蛋白WIPI2的定位变化;光漂白实验观察相变蛋白p62与WIPI2的荧光漂白恢复;通过免疫荧光观察WT、p62 KO和Atg2AB DKO细胞中WIPI2与p62的定位关系;通过蛋白免疫印记检测WT和p62 KO细胞中WIPI2表达量的变化。结果建立了Atg2AB DKO和p62 KO细胞系;透射电镜显示Atg2AB DKO细胞中p62附近聚集了大量囊泡;在Atg2AB DKO中,通过活细胞成像观察到tdTomatop62与WIPI2-GFP高度共定位;荧光漂白实验观察到WIPI2具有流动性;通过免疫荧光观察到,与WT细胞相比,在Atg2AB DKO中WIPI2点的数量明显增多(P<0.0001);与WT细胞相比,p62 KO细胞中WIPI2点的数量和表达量无明显变化(P>0.05)。结论无膜细胞器p62能够与具有流动性的WIPI2阳性囊泡动态融合,促进自噬体的形成。

E3泛素连接酶RFWD家族成员在肿瘤中的作用研究进展

环指和WD重复结构域(RING Finger and WD Repeat Domain,RFWD)蛋白属于E3泛素连接酶,在细胞增殖、凋亡和DNA损伤修复的调控中发挥重要作用。越来越多的证据表明,RFWD蛋白通过靶向其底物泛素化降解参与肿瘤的发生发展。RFWD蛋白在不同类型的人类恶性肿瘤中具有抑癌和促癌的不同作用,可能与其底物蛋白的功能有关。本文分析了RFWD蛋白家族成员(RFWD1,RFWD2,RFWD3)的结构和功能,总结了RFWD蛋白家族成员的已知底物,并阐明其在不同肿瘤中的不同功能。此外,本文还讨论了RFWD家族成员作为癌症治疗潜在靶点的可能及策略。

WD重复结构域相关蛋白3对胃恶性肿瘤细胞增殖的影响

目的探讨外源性基因WD重复结构域相关蛋白3(RFWD3)对胃恶性肿瘤细胞增殖的影响。方法通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库选出目的基因,实验分为shCtrl组和shRFWD3组,采用逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)检测该基因在胃癌细胞株中的表达,构建慢病毒载体,慢病毒感染胃癌细胞,通过RT-PCR检测mRNA水平目的基因的敲减率,使用Celigo仪器检测细胞增殖,采用比色法(MTT)检测RFWD3对目的细胞增殖的影响。结果通过TCGA数据库及统计分析,筛选出目的基因RFWD3。RT-PCR检测结果显示,该基因在胃腺癌细胞AGS中呈高表达(P<0.05)。慢病毒感染细胞后,shRFWD3组细胞感染效率达到80%以上。RT-PCR检测结果显示,胃腺癌细胞AGS中RFWD3基因在mRNA水平的表达量受到抑制(P<0.05),敲减率达50.7%。Celigo仪检测结果显示,经shRNA慢病毒感染AGS细胞72 h后,与shCtrl组比较,shRFWD3组细胞的增殖速率受到明显抑制(P<0.05)。结论干扰目的基因RFWD3具有抑制胃腺癌细胞AGS增殖的作用,RFWD3基因可能成为胃癌临床治疗的潜在靶点。

RFWD3在肝细胞癌中的表达及其临床相关性研究

目的探索HCC临床标本中环指和WD重复结构域相关蛋白3(ring finger and WD repeat domain 3,RFWD3)的表达情况,并结合临床资料分析其与HCC预后的相关性。方法采用RT-PCR、Western blotting和免疫组化(IHC)法检测40例HCC患者癌组织及癌旁正常肝脏组织中RFWD3的mRNA及蛋白表达量,并运用GEPIA数据库分析RFWD3的表达和生存情况作为补充验证,同时结合临床资料分析其与HCC预后之间的相关性。结果RT-PCR、Western blotting和IHC检测发现,与癌旁组织相比,HCC组织中RFWD3的表达显著升高(P<0.05)。临床资料分析发现,RFWD3的高表达与HCC肿瘤大小显著相关(P<0.05)。生存分析发现,RFWD3高表达的HCC患者拥有更低的总体生存率和无瘤生存期(P<0.05)。结论RFWD3基因的高表达参与了HCC的发生和发展,可能是HCC一个重要的不良预后因素。

FBXW7/MCM7信号轴介导肝癌细胞增殖的研究

目的 探讨FBXW7靶向调控MCM7表达对肝癌细胞增殖的影响。方法 采用免疫共沉淀法(CoIP)和免疫荧光染色法(IF),分析肝癌细胞系MHCC-97H中FBXW7与MCM7的互作关系;通过慢病毒感染过表达FBXW7和(或) MCM7,小干扰RNA技术下调FBXW7和(或) MCM7的表达;采用Western blot检测FBXW7对MCM7蛋白表达的影响,CCK-8实验检测肝癌细胞的增殖活性,EdU细胞增殖检测分析肝癌细胞的增殖能力,平板克隆实验分析肝癌细胞的集落形成能力。结果 在MHCC-97H细胞中,FBXW7与MCM7存在互作关系:过表达FBXW7抑制了MCM7的蛋白表达水平、并抑制了肝癌MHCC-97H细胞的增殖(P <0.05),在过表达FBXW7的基础上增加MCM7的表达后,细胞增殖能力提高(P <0.05);下调FBXW7后细胞中MCM7表达增加、细胞增殖能力增强(P <0.05),而下调FBXW7的同时干扰MCM7表达后,细胞增殖能力减弱(P <0.05)。结论 FBXW7能抑制肝癌细胞增殖,其机制与负向调节肝癌细胞中促癌蛋白MCM7的表达水平有关。

RFWD3基因重组慢病毒表达载体的构建及RFWD3蛋白在宫颈癌细胞中的功能验证

目的构建E3泛素化连接酶环指与WD重复结构域蛋白(RING finger and WD repeat domain,RFWD3)的慢病毒表达载体,研究RFWD3对宫颈癌细胞增殖与迁移能力的影响。方法以宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板扩增RFWD3基因片段,利用DNA重组技术,将上述片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(简称pCDH)中,构建pCDH-RFWD3重组真核表达质粒。经酶切及测序验证准确后,采用三质粒慢病毒包装系统包装RFWD3病毒,通过梯度稀释法感染人胚肾上皮细胞(293T)检测病毒滴度。随后采用RFWD3慢病毒液感染宫颈癌HeLa细胞,运用Western blot实验检测慢病毒转导后HeLa细胞中RFWD3蛋白的表达水平,进一步通过CCK-8和细胞划痕实验检测过表达RFWD3蛋白对HeLa细胞增殖与迁移能力的影响。结果可表达RFWD3蛋白的pCDH-RFWD3慢病毒载体获成功构建。包装RFWD3慢病毒,建立稳定表达RFWD3蛋白的宫颈癌HeLa细胞系。RFWD3慢病毒转导后的HeLa细胞与对照细胞相比,其细胞增殖与迁移能力显著增强(P<0.05)。结论RFWD3能够显著增强宫颈癌HeLa细胞的增殖与迁移能力。

FBW7通过促进NOX1降解抑制ox-LDL诱导的颗粒细胞凋亡

目的:探讨含F框及WD重复结构域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing protein 7,FBW7)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopretion,ox-LDL)诱导的颗粒细胞(granulosa cells,GCs)损伤的影响,并分析其机制。方法:收集从不同肥胖程度育龄期女性分离的GCs、从高脂饮食(high-fatty diet,HFD)喂养大鼠分离的GCs及ox-LDL处理的大鼠GCs,用Western blot法检测FBW7的表达。用编码FBW7的腺病毒载体(Ad-FBW7)感染大鼠GCs后,再用ox-LDL(80 mg/L)处理细胞48 h,分别用CCK-8法、Annexin V/PI染色法、光泽精化学发光法和Western blot法检测细胞活力、细胞凋亡、NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)活性和NOX关键亚基的蛋白表达。用环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)追踪法评估过表达FBW7对NOX1降解的影响。结果:在肥胖育龄期女性的GCs、HFD喂养大鼠的GCs和ox-LDL处理的GCs中FBW7低表达(P<0.05)。过表达FBW7能抑制ox-LDL诱导的GCs损伤、NOX活性和NOX1表达(P<0.05)。CHX追踪法实验结果显示,在ox-LDL存在的条件下,过表达FBW7能加速NOX1的降解(P<0.05)。结论:过表达FBW7可通过加快NOX1降解而减弱NOX活性,从而减轻ox-LDL导致的GCs损伤。

RFWD3在胃癌AGS细胞中的表达及其对凋亡的影响

[目的]探讨外源性基因环指和WD重复结构域相关蛋白3(RFWD3)对胃癌凋亡的影响。[方法]TCGA数据库选出目的基因,实验分shCtrl组(对照组)和shRFWD3组,RT-PCR检测该基因在胃癌细胞株中的表达,构建慢病毒载体,慢病毒感染胃癌细胞,WB检测RFWD3被敲减后蛋白的表达,流式细胞仪检查凋亡率,然后检测caspase3/7蛋白的活性,观察细胞凋亡的情况。[结果]通过TCGA数据库及统计分析,筛选出目的基因RFWD3,RT-PCR检测该基因在胃癌AGS细胞中表达较高与其他3种胃癌细胞(MGC-803、BGC-823、SGC-7901)相比P<0.05,慢病毒感染胃癌AGS细胞后感染率80%,WB检测RFWD3被敲减后蛋白的表达下降,流式细胞仪检测shRFWD3组发生凋亡的AGS细胞显著增加,通过检测caspase3/7蛋白,显示shRFWD3组caspase3/7蛋白活性显著升高(P<0.05)。[结论]干扰目的基因RFWD3促进胃癌AGS细胞的凋亡,为胃癌的科学研究与临床治疗提供可能的机制研究。

扶正抗癌方联合吉非替尼对A549细胞的协同抗癌作用及机制

目的:通过体外体内实验观察扶正抗癌(FZKA)方联合吉非替尼(Gefitinib)对人肺腺癌A549细胞增殖,凋亡及侵袭转移能力的影响,并探讨研究其相关作用机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测空白组,FZKA方组(0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 g·L^-1),Gefitinib组(10,20,40,60,80,100μmol·L^-1)的干预A549细胞24,48,72 h及FZKA方(2 g·L^-1)联合Gefitinib(40μmol·L^-1)组干预A549细胞24 h的增殖能力;流式细胞术分析检测联合用药组细胞凋亡及周期的变化;划痕实验和transwell小室实验检测联合用药组的侵袭转移能力变化;蛋白免疫印迹法检测细胞联合用药组活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax),F-盒和含蛋白7的WD重复结构域(FBW7)及髓样细胞白血病-1(MCL-1)蛋白表达的变化情况。结果:与空白组比较,FZKA方,Gefitinib呈剂量依赖性、时间依赖性显著抑制A549细胞的增殖(P<0.05);与空白组比较,FZKA方组,Gefitinib组均能减弱细胞划痕愈合能力和侵袭能力,促进细胞凋亡(P<0.05),均能上调Bax,Caspase-3,FBW7蛋白表达,下调Bcl-2,MCL-1蛋白表达(P<0.05);与Gefitinib单独给药比较,FZKA方联合Gefitinib抑制A549细胞增殖能力和诱导细胞凋亡更明显(P<0.05);细胞划痕愈合能力与侵袭能力明显减弱(P<0.05);上调Bax,Caspase-3,FBW7蛋白表达,下调Bcl-2,MCL-1蛋白表达效果明显(P<0.05)。结论:FZKA方与Gefitinib合用后比单用Gefitinib更能诱导A549细胞凋亡,抑制其增殖及侵袭转移能力更强,两者具有协同抗癌作用,其机制可能与调控FBW7/MCL-1通路相关。

形态学检测在自噬研究中的应用

自噬是降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白,维持细胞更新和稳态的关键细胞过程。自噬可分为三个相对独立的步骤:自噬泡起始形成阶段、自噬小体形成阶段以及成熟降解阶段,每个阶段都有其相对独特的形态学特征或分子标志物变化。本文综述了自噬研究中常用的形态学研究方法、结果阐释及这些过程中的关键注意事项。