下调含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1(UHRF1)的水平可抑制肾癌769-P细胞增殖并促进其凋亡

目的利用针对含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1(UHRF1)的小干扰RNA(siRNA)在肾癌769-P细胞中下调UHRF1的表达,探讨其对769-P细胞增殖和凋亡的影响。方法根据人UHRF1的mRNA序列设计并合成2对针对UHRF1的siRNA,用脂质体将其瞬时转染入769-P细胞。利用实时定量PCR检测UHRF1 mRNA的水平,Western blot法检测UHRF1的蛋白水平;利用MTT法检测细胞增殖,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)染色结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果 UHRF1 siRNA可显著抑制UHRF1的mRNA和蛋白水平,下调769-P细胞UHRF1水平后,细胞增殖显著减弱,细胞凋亡显著增加。结论下调UHRF1的表达可抑制肾癌细胞的增殖并促进其凋亡。

过表达microRNA-144通过靶向调节泛素样PHD和环指结构域1基因诱导非小细胞肺癌凋亡

目的探讨microRNA-144 (miR-144)对非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)细胞增殖以及预后的影响。方法通过癌症基因组图谱(The cancer genome atlas,TCGA)检测NSCLC患者组织中miR-144以及泛素样PHD和环指结构域包含1(Ubiquitin like PHD and ring finger domain 1,UHRF1)的表达预后以及两者表达的相关性。采用CCK-8、AO/EB以及γH2A检测不同表达miR-144对NSCLC细胞活性、细胞凋亡、增殖以及DNA损伤的影响,Western blot检测PCNA、Bax、Bcl-2及UHRF1的表达。荧光素酶报告证明miR-144以及UHRF1的靶向关系。结果在NSCLC患者组织中,miR-144表达水平较低,低表达miR-144 NSCLC患者生存时间明显低于高表达miR-144者。UHRF1在NSCLC患者组织中明显升高,且在不同年龄、性别、TNM分期和种族有显著差异。低表达UHRF1非小细胞肺癌患者生存率明显高于高表达UHRF1的NSCLC患者。过表达miR-144能够明显降低A549细胞活性,诱导A549细胞凋亡,增加γH2ax表达;抑制PCNA以及Bax蛋白表达,上调Bcl-2表达。荧光素酶报告证明UHRF1是miR-144的靶基因。同时,低表达miR-144能够使UHRF1表达增加,过表达miR-144能够抑制UHRF1的表达。结论过表达miR-144通过靶向UHRF1诱导A549细胞凋亡以及DNA损伤,参与NSCLC的病理生理过程,进而影响预后。

泛素连接酶dTraf2依赖环指结构域正调控果蝇Imd固有免疫反应

为探究果蝇肿瘤坏死因子受体相关因子2(drosophila tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,dTraf2)对免疫缺陷(immune deficiency,Imd)信号通路的调控作用,构建dTraf2和dTraf2^(ΔRING)表达载体以及转基因果蝇。利用双荧光素酶报告基因系统、RT-PCR及黏质沙雷菌(Serratia marcescens,SM)感染果蝇的方法,检测dTraf2对Imd信号通路下游抗菌肽表达、果蝇感染病原菌后存活率以及体内病原菌增殖情况的影响。结果显示,过表达dTraf2可显著促进Imd信号下游抗菌肽的表达;dTraf2正调控Imd信号依赖于其泛素连接酶活性;过表达缺失环指(RING finger,RING)结构域的dTraf2对果蝇Imd信号通路下游抗菌肽的表达无明显影响。过表达dTraf2果蝇感染革兰阴性病原菌后抗菌肽表达水平升高,且其存活率亦升高,并抑制了体内病原菌的增殖;在免疫组织里敲低dTraf2可明显抑制Imd信号依赖的果蝇固有免疫反应。该研究提示,dTraf2依赖其RING结构域正向调控果蝇Imd固有免疫反应。

泛素样含植物同源结构域和环指域1表达水平与肿瘤患者预后关系的Meta分析

目的:探讨泛素样含植物同源结构域和环指域1(UHRF1)表达水平与肿瘤患者预后的关系。方法:应用计算机检索TheCochraneLibrary、EMBASE、PubMed、万方、知网及维普等数据库中关于UHRF1表达与肿瘤预后相关性的文献,检索时间从建库至2019年5月,由两位研究员对文献进行筛选并收集相关资料。按照检索词在各数据库经检索、初筛后最终纳入12篇文献,共1467例肿瘤患者,并按照肿瘤部位,分为消化道肿瘤及非消化道肿瘤两个亚组。采用StataSE12.0软件对肿瘤预后数据进行Meta分析。结果:研究纳入的12篇文献中1467例恶性肿瘤患者经Meta分析结果显示,UHRF1高表达的肿瘤患者预后差,总生存期较短,危险概率(HR)=2.30,95%置信区间(95%CI):1.93~2.74,P<0.05;亚组分析显示,UHRF1高表达的消化道肿瘤和非消化道肿瘤患者总生存期均较短,其中消化道肿瘤:HR=2.18,95%CI:1.77~2.69,P<0.05;非消化道肿瘤:HR=2.58,95%CI:1.90~3.51,P<0.05)。UHRF1高表达与肿瘤患者的无进展生存期无相关(HR=1.14,95%CI:0.68~1.91,P>0.05)。结论:UHRF1高表达与总生存期相关,是影响肿瘤预后的一个危险因素。

食管鳞癌组织中BARD1的表达及与淋巴结转移的关系

目的分析食管鳞癌(ESCC)中乳腺癌易感基因1相关环指结构域蛋白1(BARD1)的表达及与淋巴结转移的关系。方法纳入2018年1月至2021年12月本院收治且经组织病理学检查确诊的114例ESCC患者,免疫组化EnVision两步法检测癌组织与癌旁组织中BARD1的表达情况并比较BARD1阳性率,分析BARD1表达与ESCC临床病理特征的关系,建立Logistic回归模型分析BARD1表达对ESCC淋巴结转移的影响,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析BARD1表达对ES⁃CC淋巴结转移的预测价值。结果114例ESCC组织中BARD1阳性78例、阴性36例,对应癌旁组织中BARD1阳性23例、阴性91例,ESCC组织的BARD1阳性率为68.42%,高于癌旁组织的20.18%(χ^(2)=53.769,P<0.001)。BARD1表达与ESCC患者的T分期、分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05),其中淋巴结转移组织的BARD1阳性率为80.36%(45/56),高于未转移组织的56.90%(33/58)。经Phi系数分析发现,BARD1表达与ESCC淋巴结转移呈正相关(r=0.276,P=0.003)。BARD1阳性是ESCC患者淋巴结转移的独立危险因素(OR=3.099,95%CI:1.339~7.175,P=0.008),且BARD1表达对ESCC患者淋巴结转移具有一定预测价值(AUC=0.636,P=0.020)。结论BARD1在ESCC中高表达,其与ESCC淋巴结转移密切相关,BARD1阳性会增加淋巴结转移风险,在评估ESCC淋巴结转移上有一定价值。

卡瑞利珠单抗结合DSOX方案对晚期胃癌患者血清BARD1、TAP表达的影响

目的探讨卡瑞利珠单抗结合多西他赛+奥沙利铂+替吉奥(DSOX)方案对晚期胃癌患者血清乳腺癌肿瘤易感基因(BRCA)1相关环指结构域蛋白(BARD)1、肿瘤异常蛋白(TAP)表达的影响。方法选取116例晚期胃癌患者116例按照随机数字表分为对照组及观察组各58例,对照组给予DSOX化疗,观察组在对照组基础上静脉注射卡瑞利珠单抗,观察两组临床预期生存时间、临床有效率、化疗后不同血清TAP水平变化及治疗前后血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)199、CA125表达水平变化、血清CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)表达水平、患者临床症状、BARD1及TAP表达比较。结果治疗后观察组治疗临床有效率明显优于对照组(P<0.05)。治疗后,相比于观察组,对照组患者生存时间显著缩短(P<0.05)。观察组与对照组CEA、CA199、CA125及CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。治疗前,两组BARD1及TAP表达水平无明显差异(P>0.05),治疗后,两组上述而指标表达差异存在统计学意义(P<0.05)。结论卡瑞利珠单抗结合DSOX方案治疗晚期胃癌患者,对患者生存率有提高作用,有较好的治疗疗效,对血清CA125、CA19-9、CEA水平有降低作用,降低胃癌患者血清肿瘤标志物水平,同时研究发现血清和胃癌患者组织中BARD1表达升高,其血清水平与胃癌的恶性程度和预后存在相关性,提示BARD1可能与胃癌的发生发展有关,同时患者血清TAP水平与其疗效及预后有关。

胃癌患者血清BARD1水平及临床意义

目的探讨胃癌患者血清的BRCA1相关环指结构域-1(BARD1)水平及其临床意义。方法 GEPIA数据库在线分析胃癌组织和正常组织的BARD1水平;实时定量PCR(QPCR)检测2014年1月至2017年12月本院收治的177例胃癌患者及173例健康体检者的血清BARD1水平,分析血清BARD1水平与胃癌临床病理特征的关系。根据随访资料分析血清BARD1水平与胃癌预后的关系。结果 GEPIA数据库在线分析显示408例胃癌组织BARD1水平的中位数为3.87,高于36例正常组织的1.36(P<0.05);QPCR检测结果显示,177例胃癌患者的血清BARD1水平为4.034±1.941,高于健康体检者的1.427±0.799(t=16.367,P<0.001)。血清BARD1水平与性别、年龄、肿瘤位置和浸润深度无关(P>0.05),而与肿瘤直径、分化程度、Bormann分型、淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关(P<0.05)。BARD1低水平者的中位总生存期为39.0个月,长于高水平者的36.0个月(P<0.05),多因素分析显示血清BARD1水平是影响胃癌预后的独立因素(OR=3.145,95%CI:2.897~4.268,P=0.017)。结论胃癌患者组织和血清中BARD1表达上调,该指标的血清水平与胃癌的恶性程度和预后有关,提示BARD1可能与胃癌的发生发展有关。

E3泛素连接酶RFWD家族成员在肿瘤中的作用研究进展

环指和WD重复结构域(RING Finger and WD Repeat Domain,RFWD)蛋白属于E3泛素连接酶,在细胞增殖、凋亡和DNA损伤修复的调控中发挥重要作用。越来越多的证据表明,RFWD蛋白通过靶向其底物泛素化降解参与肿瘤的发生发展。RFWD蛋白在不同类型的人类恶性肿瘤中具有抑癌和促癌的不同作用,可能与其底物蛋白的功能有关。本文分析了RFWD蛋白家族成员(RFWD1,RFWD2,RFWD3)的结构和功能,总结了RFWD蛋白家族成员的已知底物,并阐明其在不同肿瘤中的不同功能。此外,本文还讨论了RFWD家族成员作为癌症治疗潜在靶点的可能及策略。

沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息学分析

为探讨沙田柚自交不亲和性的机理,利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,通过差异分析得到了沙田柚RING-H2 finger基因序列。采用生物信息学方法,对其编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因全长为845 bp,开放阅读框(ORF)全长为387 bp,编码128个氨基酸,编码蛋白质的分子量为13.61 KDa,理论等电点为4.26;该蛋白质含有一个植物RING-H2 finger蛋白家族的保守结构域,为疏水性不稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与甜橙(Cs4g15340.1)RING-H2 finger蛋白的相似度为98%。这些分析结果可为今后深入研究该蛋白的结构特征和功能提供参考。

核蛋白因子泛素样含锌指状结构域和环指域1在乳腺癌组织的表达及意义

目的观察核蛋白因子泛素样含锌指状结构域和环指域1（UHRF1）在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达。 方法采用实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法及Western blot法检测40例乳腺癌组织及30例正常乳腺组织中UHRF1基因的mRNA的表达及其在蛋白水平的表达，并分析UHRF1的表达与临床相关病理参数间的关系。结果UHRF1 mRNA在乳腺癌组织中的表达量（1.34±0.03）明显高于正常乳腺组织（0.61±0.03）；其蛋白表达明显高于正常乳腺组织。乳腺癌组织中UHRF1的表达水平与临床分期及是否有淋巴结转移明显相关。结论UHRF1的阳性表达与乳腺癌的发生有关。

RFWD3在肝细胞癌中的表达及其临床相关性研究

目的探索HCC临床标本中环指和WD重复结构域相关蛋白3(ring finger and WD repeat domain 3,RFWD3)的表达情况,并结合临床资料分析其与HCC预后的相关性。方法采用RT-PCR、Western blotting和免疫组化(IHC)法检测40例HCC患者癌组织及癌旁正常肝脏组织中RFWD3的mRNA及蛋白表达量,并运用GEPIA数据库分析RFWD3的表达和生存情况作为补充验证,同时结合临床资料分析其与HCC预后之间的相关性。结果RT-PCR、Western blotting和IHC检测发现,与癌旁组织相比,HCC组织中RFWD3的表达显著升高(P<0.05)。临床资料分析发现,RFWD3的高表达与HCC肿瘤大小显著相关(P<0.05)。生存分析发现,RFWD3高表达的HCC患者拥有更低的总体生存率和无瘤生存期(P<0.05)。结论RFWD3基因的高表达参与了HCC的发生和发展,可能是HCC一个重要的不良预后因素。

针灸对子宫内膜异位症大鼠异位内膜组织UHRF1和DNMT1的影响

目的:观察针灸对子宫内膜异位症(EMS)泛素样PHD和含环指结构域蛋白1(UHRF1)和DNA甲基转移酶1(DNMT1)的影响。方法:将40只Sprague-Dawley大鼠按体质量随机分为假手术组10只和造模组30只。造模组大鼠复制EMS模型后随机分为模型组、针灸组和孕酮组,每组10只。固定器固定各组大鼠。假手术组和模型组予以生理盐水灌胃;针灸组予以针刺血海和三阴交,艾灸关元和生理盐水灌胃;孕酮组给予地屈孕酮生理盐水混悬液灌胃。治疗28 d后,测量大鼠异位囊肿三径(长、宽及厚度)并计算体积,减掉干预前异位囊肿体积,取差值评估异位囊肿生长情况;实时荧光定量聚合酶链反应和免疫组织化学法检测正常子宫内膜、在位及异位内膜组织UHRF1、DNMT1 mRNA和蛋白水平。结果:针灸组和孕酮组异位囊肿体积差值无统计学差异(P>0.05),但均小于模型组异位囊肿体积差值(P<0.05)。模型组异位内膜组织UHRF1、DNMT1 mRNA和蛋白水平低于正常子宫内膜组织(P<0.05);模型组在位内膜组织DNMT1 mRNA以及UHRF1蛋白水平低于正常子宫内膜组织(P<0.05);针灸组异位内膜组织UHRF1 mRNA及蛋白水平、DNMT1蛋白水平高于模型组异位内膜组织(P<0.05),其中UHRF1 mRNA水平高于孕酮组(P<0.05);针灸组在位内膜组织DNMT1 mRNA水平高于模型组在位内膜组织(P<0.05);针灸组异位内膜组织UHRF1、DNMT1 mRNA和蛋白水平与正常子宫内膜比较无统计学差异(P>0.05)。结论:针灸可能通过上调异位内膜组织中UHRF1 mRNA和UHRF1、DNMT1蛋白水平,使其趋于正常子宫内膜水平,从而达到缩小异位囊肿体积,治疗大鼠子宫内膜异位症的效应。

小鼠睾丸组织特异表达基因Rnf148的鉴定及其编码E3泛素连接酶的功能分析

目的研究小鼠Rnf148基因表达的时空特异性及其环指结构域的E3泛素连接酶功能。方法提取不同成年小鼠组织、不同胚胎期组织和出生后小鼠睾丸组织的总RNA,通过实时荧光RT-PCR和Northern杂交分析小鼠Rnf148基因的表达谱。构建包含整个Rnf148蛋白的环指结构域与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白原核表达载体,在BL21细菌中诱导表达后,经GST琼脂糖凝胶纯化GST-Rnf148重组蛋白。体外泛素化反应试验检测GST-Rnf148重组蛋白的E3泛素连接酶功能。结果在小鼠13种不同器官组织中,Rnf148mRNA仅存在于睾丸组织中。进一步Northern杂交验证了只在小鼠睾丸组织表达一个1.2kb左右的Rnf148基因mRNA片段。小鼠Rnf148基因在胚胎期及出生后3周内不表达,出生后21d开始表达,25d后达到表达高峰并一直持续表达。实验成功诱导表达并纯化了GST-Rnf148重组蛋白,体外蛋白泛素化反应显示该重组蛋白具有E3泛素连接酶的功能。结论小鼠Rnf148基因特异地表达在出生3周后的睾丸组织中,Rnf148蛋白的环指结构域具有泛素连接酶活性。

RNF185的克隆及过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的克隆RNF185全长基因,构建真核表达载体,检测其蛋白表达和亚细胞定位,并探讨RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 TRIzol法提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,经RT-PCR反应扩增出RNF185基因,并通过酶切连接将其构建到真核表达载体pCMV-Myc和pEGFP-N1上,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序。测序正确后抽提质粒作为模板扩增N端截短体,构建其真核表达载体。转染MC3T3-E1检测其蛋白表达及亚细胞定位情况。采用碱性磷酸酶染色法分析RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。结果①完成了RNF185的分子克隆,构建的真核表达载体pCMV-Myc-RNF185测序正确,所获得的序列与GenBank中收录的序列完全一致,N端截短体测序正确;②成功转染至MC3T3-E1细胞,蛋白相对分子质量大小与预期一致,全长形式定位于质膜;③RNF185及其N端截短体过表达均可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。结论 RNF185过表达可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。

BARD1基因单核苷酸多态性和神经母细胞瘤关联性的Meta分析

目的评价乳腺癌易感基因1（BRCAJ）相关环指结构域-1（BARD1）基因的rs6435862和rs3768716单核苷酸多态性和神经母细胞瘤㈧B1易感性的关联。方法计算机检索PubMed、Embase、WebofScience、中国知网和万方数据库自建库至2018年5月10日收录的BARD，基因单核苷酸多态性与NB易感性的相关文献。筛选后提取文献的信息。采用纽卡斯尔-渥太华量表（NOS）评价文献的质量：采用RevMan5．3软件对资料进行Meta分析，观察等位基因模型、纯合子模型、杂合子模型、显性模型及隐性模型下rs6435862和rs3768716多态性和NB易感性的关系。结果最终纳入5篇文献（共9项独立研究1，包括3597例NB患者和10827例健康对照者。NOS评价显示文献均≥6颗星，提示均为高质量研究。Meta分析结果显示在5种遗传模型下，rs6435862、rs3768716多态性和NB易感性均有关，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论BARD1基因的rs6435862、rs3768716单核苷酸多态性和NB易感性有显著关联。这2个位点的G．等位基因和GG．基冈型携带者患NB的风险较高。

DNA甲基化在肝脏再生中的研究现状与展望

目的总结目前DNA甲基化与肝脏再生关系的研究现状。方法检索国内外相关文献,对肝细胞甲基化水平、基因表达调控、甲基化相关蛋白与肝脏再生关系的研究进行综述。结果 DNA甲基化作为生物体内一种重要的表观遗传调控方式,近年来在肝脏再生中的作用越来越被重视。现有的研究已经发现,在肝脏再生过程中存在基因组低甲基化、相关增殖基因甲基化改变以及DNA甲基化转移酶、含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1调控肝脏再生等表观遗传现象。结论 DNA甲基化与肝脏再生之间存在着诸多的联系,从DNA甲基化水平调节肝脏再生有望在不久的将来成为现实。

RFWD3基因重组慢病毒表达载体的构建及RFWD3蛋白在宫颈癌细胞中的功能验证

目的构建E3泛素化连接酶环指与WD重复结构域蛋白(RING finger and WD repeat domain,RFWD3)的慢病毒表达载体,研究RFWD3对宫颈癌细胞增殖与迁移能力的影响。方法以宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板扩增RFWD3基因片段,利用DNA重组技术,将上述片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(简称pCDH)中,构建pCDH-RFWD3重组真核表达质粒。经酶切及测序验证准确后,采用三质粒慢病毒包装系统包装RFWD3病毒,通过梯度稀释法感染人胚肾上皮细胞(293T)检测病毒滴度。随后采用RFWD3慢病毒液感染宫颈癌HeLa细胞,运用Western blot实验检测慢病毒转导后HeLa细胞中RFWD3蛋白的表达水平,进一步通过CCK-8和细胞划痕实验检测过表达RFWD3蛋白对HeLa细胞增殖与迁移能力的影响。结果可表达RFWD3蛋白的pCDH-RFWD3慢病毒载体获成功构建。包装RFWD3慢病毒,建立稳定表达RFWD3蛋白的宫颈癌HeLa细胞系。RFWD3慢病毒转导后的HeLa细胞与对照细胞相比,其细胞增殖与迁移能力显著增强(P<0.05)。结论RFWD3能够显著增强宫颈癌HeLa细胞的增殖与迁移能力。

RFWD3在胃癌AGS细胞中的表达及其对凋亡的影响

[目的]探讨外源性基因环指和WD重复结构域相关蛋白3(RFWD3)对胃癌凋亡的影响。[方法]TCGA数据库选出目的基因,实验分shCtrl组(对照组)和shRFWD3组,RT-PCR检测该基因在胃癌细胞株中的表达,构建慢病毒载体,慢病毒感染胃癌细胞,WB检测RFWD3被敲减后蛋白的表达,流式细胞仪检查凋亡率,然后检测caspase3/7蛋白的活性,观察细胞凋亡的情况。[结果]通过TCGA数据库及统计分析,筛选出目的基因RFWD3,RT-PCR检测该基因在胃癌AGS细胞中表达较高与其他3种胃癌细胞(MGC-803、BGC-823、SGC-7901)相比P<0.05,慢病毒感染胃癌AGS细胞后感染率80%,WB检测RFWD3被敲减后蛋白的表达下降,流式细胞仪检测shRFWD3组发生凋亡的AGS细胞显著增加,通过检测caspase3/7蛋白,显示shRFWD3组caspase3/7蛋白活性显著升高(P<0.05)。[结论]干扰目的基因RFWD3促进胃癌AGS细胞的凋亡,为胃癌的科学研究与临床治疗提供可能的机制研究。