环指蛋白4通过TAK1抑制MAPK信号通路减轻心梗后炎症反应

目的探究环指蛋白(ring finger protein,RNF)4在心肌梗死(myocardial infarction,MI)后炎症反应中的作用及其机制方法心脏特异性过表达RNF4小鼠和C57小鼠进行MI造模,分别记录其死亡率。MI后第28天取材,使用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)及Western blot方法检测NRF4过表达对MI后其炎症反应的影响及其机制。采用免疫共沉淀检测NRF4的相互作用蛋白及探究互作蛋白的具体结合域结果 MI模型中,RNF4蛋白及RNF4 mRNA水平显著下降(P<0.01);心脏特异性过表达RNF4小鼠与C57小鼠相比,MI后炎症反应较轻,心肌间质淋巴细胞浸入较少,同时死亡率更低。Western blot法检测证实RNF4通过抑制MAPK信号通路减轻MI后炎症反应,随后的Co-IP结果证实,RNF4可以结合和降解转化生长因子β-活化激酶1(transforming growth factor-beta-activated kinase 1,TAK1);最后通过截短TAK1发现,RNF4与TAK1的第301位氨基酸至第480位氨基酸结构域结合结论 RNF4通过募集和降解TAK1抑制MAPK信号通路减轻MI后炎症反应,降低MI后死亡率。RNF4可以作为改善MI预后的潜在靶点,具有重大临床意义。

候选蛋白多聚胞嘧啶结合蛋白1与泛素连接酶环指蛋白4交互作用的研究

目的 :寻找与类泛素(small ubiquitin-like modifier,SUMO)介导的泛素连接酶(SUMO-targeted ubiquitin ligase,STUbL)环指蛋白(ring finger protein 4,RNF4)相互作用的蛋白以及底物,为相关疾病的分子靶向治疗提供理论依据和实验数据。方法:采用酵母双杂交技术在人脑互补DNA文库、高灵敏质谱分析技术在RNF4过表达细胞系中筛选出一批与RNF4相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀(CO-IP)实验验证候选蛋白是否确实与RNF4发生相互作用,采用相同实验检测候选蛋白是否可被SUMO化修饰。结果:酵母双杂交和高灵敏质谱分析技术筛选出77个候选蛋白。验证了采用2种方法均筛出的多聚胞嘧啶结合蛋白1[poly(rC)binding protein 1,PCBP1]可与RNF4交互作用,并且CO-IP实验证实PCBP1可以与SUMO相互作用。结论:PCBP1与RNF4存在交互作用,PCBP1蛋白可以被SUMO化修饰,RNF4可能通过调控SUMO化的PCBP1的降解来影响其功能。

沉默内源性RNF4通过激活p53通路诱导乳腺癌细胞凋亡

目的环状泛素连接酶环指蛋白4(RNF4)可增强多种致癌转录因子的稳定性及活性,对肿瘤的生长发展至关重要。在乳腺癌患者中,高水平的RNF4 mRNA与患者的低生存率相关。本研究在离体和在体水平上,探讨沉默乳腺癌细胞中内源性RNF4的表达对于肿瘤生长的抑制作用,并探讨相关分子机制。方法用慢病毒载体系统构建稳定沉默RNF4的乳腺癌细胞系,在离体实验中用CCK-8法检测细胞增殖活力,并用Western-Blot法检测RNF4沉默水平和促凋亡蛋白p53的表达;在体方面,建立皮下荷乳腺癌裸小鼠模型,定期测量裸小鼠皮下瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,称量瘤体重量以及检测瘤组织中RNF4和p53的表达。结果与对照组相比,稳定沉默内源性RNF4后,肿癌细胞的增殖活性被显著抑制且促凋亡蛋白p53表达升高;在荷乳腺癌裸小鼠模型中,稳定沉默RNF4组小鼠的肿瘤生长缓慢、肿瘤瘤体体积减小、瘤重减轻且瘤组织中p53表达水平升高。结论沉默乳腺癌细胞中内源性RNF4可上调p53的表达,激活p53通路,从而诱导肿瘤细胞凋亡,有效抑制在体肿瘤的生长。