番木瓜环斑病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)是瓜类作物主要病毒之一,分析了甜瓜分离物HaNHK10的基因组序列和分子变异,构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示,HaNHK10分离物基因组全长为10332 nt,与其他分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为74.60%~97.80%和85.30%~98.50%。基于全基因组序列的系统进化分析显示,HaNHK10与来自中国的所有分离物均聚集于II组中,并与中国山东的西葫芦分离物PRSV-SD亲缘关系最近。接种试验显示,HaNHK10分离物的全长cDNA克隆具有侵染性,它能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦和瓠瓜6种作物,经接种产生的病毒后代也能够通过摩擦接种侵染植株。

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

基因沉默番木瓜环斑病毒复制酶基因(PRSV-Nib)获得抗病毒病番木瓜的研究

番木瓜是重要的热带经济水果。番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是番木瓜的重要病毒病,经常导致严重的产量损失和质量恶化。自从1998年第一例转基因番木瓜问世以来,使得基于“致病菌衍生的抗病性(pathogen-derived resistance,PDR)”的抗病育种策略获得成功广泛应用。然而依赖于序列同源性的抗病性与病毒突变导致多样性增加之间的矛盾成为番木瓜育种科学家的新挑战。本研究拟采用RNAi策略针对复制酶(nuclear inclusion b.Nib)获得广谱抗PRSV番木瓜新种质。通过团队已建立的胚性愈伤诱导-农杆菌介导转化-再生苗诱导的番木瓜遗传转化体系,共获得经过抗性筛选的再生苗52株,通过特异性PCR进行筛选共计获得24株转基因阳性植株。通过对T0代田间自然发病试验中,转基因番木瓜株系抗病性明显高于非转基因对照,其中NibB5-2田间抗病性最优。通过hiTAIL-PCR方法确定NibB5-2插入位点位于第2号染色体supercontig_30的1976766的位置。T1代接种试验中,无病毒积累且无发病症状,初步确认具有良好的病毒抗性,为番木瓜抗病育种提供新思路。

福建番石榴环斑病菌的分离鉴定、生物学特性及抑制剂筛选

【目的】明确番石榴果实采后环斑病发生的致病病原菌及其对番石榴果实采后品质的影响,筛选能抑制该病原菌的有效抑制剂。【方法】病原菌分离于发生环斑病的番石榴果皮病健交界处,并对该致病菌进行形态学鉴定、分子鉴定与系统发育树分析。另外,初步研究番石榴环斑病菌的生物学特性、环斑病菌侵染对果实采后品质的影响和评价不同抑制剂(ε-聚赖氨酸、水杨酸和褪黑素)对环斑病菌的体外抑菌效果。【结果】根据环斑病菌的菌丝与分生孢子的形态特征及基于rDNA-ITS、TUB和TEF-1α测序结果构建的系统发育树,将福建番石榴环斑病菌鉴定为棒状新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)。葡萄糖和D-果糖、蛋白胨、7、25℃分别作为番石榴N. clavispora菌丝生长的最适碳源、氮源、pH、温度。此外,与未接种N. clavispora番石榴果实相比,接种N. clavispora果实具有较高的病斑直径和细胞膜透性,较低的果实硬度和色调角h值。体外试验表明,适当浓度的ε-聚赖氨酸、水杨酸和褪黑素处理对番石榴N. clavispora的菌丝生长有明显的抑制作用,可作为抑制N. clavispora侵染所致番石榴果实采后环斑病的抗菌剂。【结论】引起福建番石榴果实环斑病的病原菌为棒状新拟盘多毛孢(N. clavispora),且4.000 mg·mL^(-1)ε-聚赖氨酸对病原菌具有很好的抑制效果,可为后续番石榴环斑病的防治研究提供科学依据。

甘蔗环斑病致病菌的鉴定及生物学特性分析

甘蔗环斑病是甘蔗常见的一种病害,在我国广东、广西等地较为常见。本研究从广西玉林地区的甘蔗病叶中分离到1株真菌菌株,命名为YLES 1,并按照科赫氏法则对分离菌进行致病性测定,证实了分离菌是甘蔗环斑病的病原菌。通过病原菌的形态观察,发现该真菌与附球菌属(Epicoccum)的形态特征类似。基于分离菌株的核糖体DNA转录间隔区(ITS)、大亚基r DNA(LSU)及β-微管蛋白(Tu)基因序列构建多基因联合系统发育树,其中确定YLES 1属于E.sorghinum,是甘蔗环斑病的病原物。该菌株的生物特性分析结果显示,YLES 1菌株生长的最适温度为28℃,菌丝生长和产孢的最适pH为7~9,最适生长和产孢碳源为蔗糖,最适氮源为酵母浸粉,且全黑暗的条件有利于菌YLES 1的生长。

闽西南莒林环斑花岗岩特征及地质意义

莒林环斑花岗岩属胡坊复式岩体的重要组成部分,主要岩性为似斑状黑云母正长花岗岩,岩石具更长环斑结构,环斑长石由钾长石内核和斜长石(更长石)外壳环边组成。岩石富Si、NK、K,贫Al、Ca、Mg;LILE元素K、Rb、Th、U、Pb、REE富集,Eu、Ba、Nb、Sr强烈亏损;HFSE元素Zr、Th、Ce富集,P、Ti明显缺失,Nb、Ta、Y、Hf相对亏损;稀土元素总量高、轻稀土富集,具强烈的Eμ负异常(δEμ=0.09~0.34),具A型花岗岩的地球化学特征。2件样品LA-ICPMS锆石U-Pb同位素年龄为(232.9±1.4)Ma、(226±1.4)Ma,属中三叠世,其形成与闽西南地区印支期的阶段性伸展拉张构造背景有关。

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备

李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^(PNRSV),转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。

蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的实时荧光定量PCR检测

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,简称ORSV)是蝴蝶兰生产中的主要病毒病害,建立稳定、灵敏的检测体系是进行病毒早期检测和脱毒技术研究的前提。本研究首先对CymMV和ORSV的外壳蛋白(coat protein,简称CP)基因片段进行克隆和序列比对,随后设计特异性引物,分别构建2种病毒的RT-qPCR(real time quantitative PCR,简称RT-qPC)检测体系,并对云南地区20份样品进行检测。研究结果显示,CymMV和ORSV CP基因序列与其他地区分离物中这2种病毒的核苷酸序列相似性分别为97.92%~98.66%和99.12%~99.56%,其CP基因序列具有保守性。CymMV和ORSV在RT-qPCR体系中最低检出浓度分别为30.9、35.0 copies/μL,灵敏度较RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,简称RT-PCR)提高10倍。利用RT-qPCR体系对20份温室样品进行检测,CymMV阳性率为100%,ORSV阳性率为90%,阳性率均高于RT-PCR检测结果。本研究构建的CymMV和ORSV RT-qPCR检测体系将为蝴蝶兰病毒病早期监测和脱毒种苗的培育奠定基础。

朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP快速检测体系的建立

为快速检测朱顶红褪绿环斑病毒(hippeastrum chlorotic ringspot virus, HCRV),根据HCRV的核壳体(N)蛋白基因保守核苷酸序列,设计了5组引物进行筛选,并采用单一变量法对RT-LAMP体系反应温度、时间、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、内外引物浓度比等进行逐一优化,建立了HCRV逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系。结果表明,最佳引物组为P1,最适反应温度为64℃,Betaine、dNTPs、Mg2+的最佳终浓度分别为0.8、0.2、6 mmol/L,最佳内外引物浓度比为5∶1,最佳反应时间50 min。检测结果显示优化后的RT-LAMP经SYBR Green I染色可通过肉眼直接判断结果,具有高度特异性,且灵敏度是常规RT-PCR的100倍。本研究为HCRV的检测提供了一种便捷、高效、可靠的方法。

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。

北秦岭老君山、秦岭梁环斑结构花岗岩岩浆混合的岩相学证据及其意义

老君山和秦岭梁岩体具有明显的岩浆混合特征。岩体中暗色包体发育,主要类型为细粒闪长质和二长质的岩浆包体,有的岩浆包体具有细粒边,有的和寄主岩石呈过渡关系。包体的矿物组合明显不平衡:出现石英-角闪石眼斑;暗色矿物中有石英包裹体;磷灰石呈针状。在包体、寄主岩石及其边界上广泛出现卵球状的碱性长石斑晶。这些混合特征表明:老君山和秦岭梁环斑结构花岗岩、环斑结构与岩浆混合关系紧密;岩浆作用也具双峰式的特点,表现为基性岩浆和酸性岩浆的混合。这为探讨该类花岗岩和环斑结构的成因提供了直接的岩石学依据。同时,也为探讨北秦岭中生代壳幔混合作用和地壳增生提供了新的信息。

答“对秦岭奥长环斑花岗岩质疑”

环斑花岗岩是一种特殊结构的花岗岩类,并且多数产在元古宙克拉通中。笔者曾报道了在秦岭造山带中发育有印支期具有环斑结构的花岗质岩石。“对秦岭奥长环斑花岗岩质疑”一文认为它们不是环斑花岗岩,并引用Ramo的图表来说明自己的观点。本文将从以下几方面进行讨论:秦岭环斑花岗岩的研究历史;环斑花岗岩的定义;世界上环斑花岗岩的成因类型;秦岭环斑花岗岩的副矿物及铁镁含量和环斑钾长石特征;秦岭环斑花岗岩与基性岩共存等。本文还论证了秦岭环斑花岗岩不同于元古宙非造山环斑花岗岩,而是一种造山型的环斑花岗岩,其形成于后造山环境,是挤压(造山)向拉张(稳定)转折时期的产物。最后对研究秦岭环斑花岗岩的几个理论问题进行了探讨。

柴达木盆地北缘鹰峰环斑花岗岩体的岩相学特征

野外调查表明，鹰峰环斑花岗岩体形成于中元古代，位于柴北缘构造带，呈透镜状夹持在剪切带间。同时代侵入的还有辉绿岩墙和石英闪长岩-奥长花岗斑岩脉，构成双峰式岩石组合。该环斑花岗岩多具无奥环结构，卵形钾长石球斑十分发育，其体积分数多在50％～60％，粒径多在2～3cm，常以多晶集合体出现，出溶作用十分强烈。基质结构有中粗粒、细粒和显微文象结构等。石英、钾长石都具两个或多个世代，黑云母多结晶较晚，按矿物定量分类多属石英正长岩和石英二长岩类。与典型环斑花岗岩相比，该岩体有出露面积小，岩石类型单调，球斑含量大，大小较均匀且为多晶集合体，出溶作用强烈，基质结构多样，变质变形明显等特征。这些特征部分起因于加里东期的改造，部分是该地区元古代岩浆作用个性的表现。

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒 (PMaLV)的外壳蛋白 (CP)基因 ,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM -TandpGEM -TEasyVectorSystem(简称T -载体 ) ,并进行了序列分析。结果表明 ,PMaLVCP基因核苷酸序列全长为 86 1nt,推导其编码 2 87个氨基酸。与番木瓜环斑病毒 (PRSV)美国夏威夷HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比 ,在第 6 6nt处开始连续缺失 3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比 ,其CP基因序列同源率分别为 96 %、98%、95 %、89%和 89%。其推导的氨基酸序列同源率分别为 98%、97%、97%、96 %和 95 %。此结果表明 ,PMaLV属于PRSV的一个株系 ,不是一种新病毒。因此 ,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系 (ML株系 )。

环斑花岗岩研究及存在的问题

综述了环斑花岩岗研究的新进展。环斑花岗岩既可以出现于从太古代到显生宙的各个地质时期 ,也可以产生于造山带中。这些不同时代、不同构造环境特别是造山带环斑花岗岩与经典的元古代克拉通上的环斑花岗岩在岩石学、地球化学和产生的构造动力学背景上有何异同是今后需要研究的问题。

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。

番木瓜环斑病毒株系、分子生物学及其防治研究进展

番木瓜环斑病毒株系、分子生物学及其防治研究进展肖火根，范怀忠（华南农业大学植物病毒研究室，广州５１０６４２）ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅＳｔｒａｉｎｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｏｆＰａｐａｙａＲｉｎｇｓｐ...

对秦岭奥长环斑花岗岩的质疑

本文介绍了环斑结构的含义及奥长环斑花岗岩的地质与地球化学特征。在此基础上对所谓的秦岭奥长环斑花岗岩带提出质疑,并提出秦岭中的一些花岗岩虽然具有环斑结构,但不是奥长环斑花岗岩。

利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒

根据番茄环斑病毒和烟草环斑病毒各分离物CP基因的保守序列分别设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,分别建立了ToRSV和TRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,在口岸病害检疫中具有广泛的应用前景。

番茄环斑病毒和烟草环斑病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的兔多克隆抗体,用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好2条病毒检测线(T线)和1条羊抗兔抗体质控线(C线),制成复合型免疫层析检测试纸条。一张试纸条在10min内,可同时检测出这两种病毒。试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg/mL,试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的混合病汁液可稀释1000倍(重量/体积)。用健康叶片和缓冲液对照测试,试纸条结果都为阴性。