华南番木瓜病毒病及环斑病毒株系的调查鉴定

根据田间调查、病毒粒子和内含体形态、血清反应、寄主范围和症状、昆虫介体、物理性质、潜育期等试验结果、认为华南４省区的番木瓜病毒病只有ＰＲＶ一种。根据在西葫芦上的症状特点，将ＰＲＶ初步区分为４个株系，即Ｙｓ、Ｖｂ、Ｓｍ和Ｌｃ。在３１３份标样中，它们单独所占比例分别为４０．５７％，１０．２２％，０．６４％，４．４７％，Ｙｓ＋Ｖｂ（复合侵染）占４４．０８％，这表明Ｙｓ为优势株系，Ｖｂ次之，Ｌｃ和Ｓｍ发生少分布不广。研究结果还表明，以前有人报道的ＰＭａＬＶ实则是本研究的Ｖｂ，而不是一个新病毒。

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒 (PMaLV)的外壳蛋白 (CP)基因 ,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM -TandpGEM -TEasyVectorSystem(简称T -载体 ) ,并进行了序列分析。结果表明 ,PMaLVCP基因核苷酸序列全长为 86 1nt,推导其编码 2 87个氨基酸。与番木瓜环斑病毒 (PRSV)美国夏威夷HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比 ,在第 6 6nt处开始连续缺失 3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比 ,其CP基因序列同源率分别为 96 %、98%、95 %、89%和 89%。其推导的氨基酸序列同源率分别为 98%、97%、97%、96 %和 95 %。此结果表明 ,PMaLV属于PRSV的一个株系 ,不是一种新病毒。因此 ,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系 (ML株系 )。

番木瓜环斑病毒西瓜株系衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

以感染番木瓜环斑病毒西瓜株系(papaya ringspot virus-watermelon strain,PRSV-W)的西葫芦叶片为供试材料,通过RT-PCR克隆PRSV-W衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,并将其连接到原核表达载体pEHISTEV上得到重组质粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。将其转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后可表达分子量约为37 kD的融合蛋白。将融合蛋白从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰长耳兔,制备PRSV-W CP的抗血清。间接ELISA测定该血清效价为1∶8192。Western blot检测结果表明,该抗血清只与感染PRSV的西葫芦样品有特异性反应,而与健康西葫芦、感染西瓜花叶病毒的西葫芦及感染马铃薯Y病毒的普通烟样品均无反应。本研究为PRSV的快速检测以及CP蛋白功能的研究奠定了基础。

西葫芦PRSV-W病毒病抗病种质鉴定及抗性遗传分析

番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)是危害西葫芦生产的主要病害之一,为减少产量损失,加快西葫芦抗病品种的选育,本研究拟通过人工苗期子叶摩擦接种,结合酶联免疫吸附测定法(ELISA)及反转录PCR(RT-PCR)检测分析,建立西葫芦PRSV-W抗性鉴定技术,并对148份西葫芦品种及高代自交系育种材料进行抗性评价,同时利用抗、感自交系构建六世代群体,探究西葫芦PRSV-W抗性遗传规律。结果表明,播种2周后最适宜对子叶进行病毒摩擦接种。接种病毒15~25 d后西葫芦抗、感特性表现充分,易于鉴别,从高抗到高感可分为0~4级。148份西葫芦种质材料中,22份种质材料表现为高度抗病,11份种质材料表现为抗病,总抗病种质材料占比22.3%;12份种质材料表现为感病,103份种质材料表现为高度感病,总感病种质材料占比77.7%。此外,在叶片组织的病毒检测中,RT-PCR技术比ELISA更为灵敏准确;在西葫芦高抗自交系BV21中,PRSV-W抗性受1对显性抗病基因控制。本研究结果为西葫芦PRSV-W抗病育种提供了种质材料及技术支持。