一株枯草芽孢杆菌环状糊精葡糖基转移酶的提取、纯化和性质

枯草芽孢杆菌SC3-2是一株高产环状糊精葡糖基转移酶（CGTase）的菌株,将其发酵液通过（NH4）2SO4分级沉淀、DEAE-纤维素（DEAE-cellulose-52）离子交换层析和Sephadex S-200凝胶层析进行纯化。经过几步纯化后CGTase比活力达到4 923 U/mg,纯化倍数达11.37倍,回收率为20%。通过对酶性质的测定,结果表明：在pH6.5,30℃条件下,菌种产酶量最高;在pH5.5-7.5,40℃以内该酶较为稳定;Mn^2＋和Ca^2＋对酶活具有一定的促进作用;EDTA、Na^＋、Fe^3＋、Cr^3＋、Zn^2＋、Cu^2＋对酶活影响不大;SDS、Ag^＋和Hg^＋使酶几乎失去活性。本研究为环状糊精葡糖基转移酶的应用提供了依据。

嗜碱细菌环状糊精葡糖基转移酶的纯化和性质

嗜碱细菌52—2除去菌体的培养液经硫酸铵沉淀和DEAE－纤维素离子交换柱层析，得到凝胶电泳均一的环状糊精葡糖基转移酶，纯化了11.5倍，酶活力回收为5.7％。用浓度梯度PAGE测分子量为151700。酶反应最适温度为65℃，50℃以下比较稳定。酶反应最适pH为7．0，在6．0～9.0范围内稳定。Zn2+、Hg2+、Pb2+、Al3+、Cu2+、Ag+和Fe2+强烈抑制酶活力。紫外光谱在270nm和244nm处分别有最大和最小吸收。荧光光谱的最大激发波长和发射波长分别为283nm和335nm。用NBS、NEM、NAI、DEP和EDC对酶进行了化学修饰，初步推测组氨酸和色氨酸残基可能为酶活力必需基因，羧基与酶活力有一定关系。

环状糊精葡萄糖基转移酶的研究进展

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉等合成环状糊精的酶,环状糊精由于具有特殊的理化性质,能将多种化学物质包接在其环形空隙中,因此在食品等领域有着广泛的应用前景。本文对环状糊精葡萄糖基转移酶的来源、酶学性质、作用机理、筛选及分子生物学方面进行了系统的综述。

环状糊精与环状糊精葡萄糖基转移酶

本文简述了环状糊精的结构性质和用途,并对环状糊精葡萄糖基转移酶的测定方法和固定化做了简要综述。

γ-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌32-3-10产酶条件及酶促反应条件的研究

筛选到一株芽胞杆菌 32 - 3- 10 ,它所产γ -环状糊精葡萄糖基转移酶可以淀粉为底物生成γ -环状糊精 ,对其产酶条件及酶促反应条件进行了研究。

β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵染菌的分离和16srDNA分析

目的:解决β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵生产过程中频繁出现的不明原因的酶活降低问题。方法:我们采用特异性酚酞筛选培养基对发酵异常的发酵液进行菌种分离,对分离得到的菌株进行16 srDNA基因序列分析,同时研究他们的发酵过程中光密度、酸碱度、酶活指标。结果:分离得到了一株可以在碱性条件下与正常生产菌共生的芽孢杆菌。经过对发酵过程进行研究,在不同的发酵时期中该菌的光密度的变化和正常生产菌有明显差异,最终酶活仅为正常菌的1/6。通过对16 srDNA基因序列进行分析,确定其为芽孢杆菌,和正常生产菌基因相似度达到93.81%。结论:在生产中采用16 srDNA基因序列分析,可以排除染杂的的生产菌种。只要严格控制发酵出发菌株和严格保证发酵环境的纯培养条件,可以防止染菌的发生。

环糊精葡糖基转移酶的酶学性质及转化特性

目的:通过对一种强碱性环糊精葡糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性研究,探索改进和提高环糊精生产效率的工艺。方法:从一株碱性土壤来源的新型产环糊精葡糖基转移酶的嗜碱性芽孢杆菌,运用乙醇沉淀、DEAE-Sepharose和HiTrap-Q离子交换柱层析等蛋白质分离纯化技术对该酶进行了纯化,测定了其酶学性质,并对其转化特性进行了研究。结果:经过微生物发酵和三步纯化,获得表观电泳纯的酶蛋白,纯化倍数为51.4,收率约9.2%。该酶的最适反应温度为50℃。酶的最适作用pH约为10,并且在pH6～pH12条件下均较稳定。用5%可溶淀粉作底物进行转化,转化率约40%。在转化过程中加入沉淀剂环己烷,产物中β-CD的比例从84%提高到95%。结论:该酶是迄今报道过的适宜pH最高的环糊精葡糖基转移酶,专一性转化生产β-CD的能力优良,具有工业化应用的潜力。

发酵生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的气球菌(Aerococcus sp·P3-2)污染及防治

我们从环状糊精生产厂家的β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵失败的发酵液中分离出一株气球菌。此菌可以在发酵专用碱性培养基上生长,但不生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶。通过研究该菌种在碱性培养基上的发酵过程中的pH、OD、酶活,同时使用16SrDNA进行分析,证明此菌种为气球菌(Aerococcussp.P3-2),其在发酵过程中可以明显降低发酵培养基的pH,对正常生产菌形成抑制。通过对发酵生产可能染菌的环节进行微生物取样分析,该菌种大量存在于空气过滤系统的积水中,从而找到污染源,由此判断是由于空气净化系统被污染所导致的发酵失败。在实际生产中定期对空气净化系统中的积水进行排放处理,同时对发酵过程中的酶活和pH进行监控,可以做到发酵污染的早发现直至杜绝发酵污染。

重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。

环糊精葡糖基转移酶法改性甜菊糖的研究

目的:优选环糊精葡糖基转移酶法对甜菊糖进行结构改变的工艺。方法:以甜菊苷酶改转移率为指标,通过对影响酶改性反应的pH、甜菊苷与淀粉的比例、反应温度、反应时间、酶的用量五个因素进行考察,首先确定pH以及甜菊苷与淀粉的比例对转化率的影响,对剩余三个因素采用正交设计考察,筛选了酶改性甜菊苷的最佳工艺。结果:最佳酶改工艺组合为:pH=6,淀粉与甜菊苷的比例为2∶1,反应温度40℃,反应时间24h,酶的用量为60u/g淀粉。结论:该方法能有效对甜菊苷进行酶改,工艺合理且操作简单。

N^+注入诱变选育β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株及其发酵条件优化

以一株产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的蜡状芽孢杆菌BC-0801为出发菌株,利用10keV,剂量为40×2.5×1013ions/cm2氮离子进行诱变选育,获得一株高产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的突变体BC-0802。对该突变体BC-0802发酵培养基的碳源、氮源及无机离子进行单因素试验分析,采用3个因素正交试验确定其最佳发酵培养基成分质量浓度及发酵条件为:玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L,发酵温度30℃、pH 9.0、接种量2%、发酵周期36h。结果表明;突变体的平均酶活力可达3415.8U/mL,相较于出发菌株酶活力提高了3.67倍,且该突变体的遗传稳定性较好。

产环状糊精葡萄糖基转移酶菌株发酵条件和部分酶学性质的研究

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉等水解为环状糊精的酶,环状糊精因其特有的理化性质,在食品等领域有着广泛的应用。本实验以一株环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ-10为研究对象,分别对该菌发酵培养基的碳源、氮源和pH进行了单因子分析,并对这三个因素进行了正交实验,最终得到该菌的最佳发酵条件。对粗酶的酶学性质研究表明,酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH为9.0,酶学特性非常适合于环状糊精的工业化生产。

产β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株XW-6-66发酵条件和酶学性质的研究

以一株β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株XW-6-66为研究对象,对其发酵条件及酶学特性进行了初步研究。该酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH为9.0,酶学特性非常适合于环状糊精的工业化生产。对该菌发酵培养基的碳源、氮源及pH进行了单因子分析,采用3个因素正交实验确定该菌的最佳发酵培养基配方为:0.3%可溶性淀粉,1.0%牛肉浸膏,1%蛋白胨,0.2%Na2CO3,0.13%K2HPO4·3H2O,0.02%MgSO4·7H2O,pH为9.0。在该条件下,菌株XW-6-66产β-CGTase的酶活由优化前2173.33u/mL提高到3622.94u/mL。

β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ10发酵条件的优化

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉水解为环状糊精的酶。以β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ10为研究对象,分别对该菌发酵培养基的碳源、氮源和pH进行了单因子分析,并对该3个因素进行正交实验及验证,最终确定该菌的最佳发酵培养基配方:玉米粉2.5%,黄豆粉5%,NaCO30.2%,K2HPO4.3H2O0.13%,MgSO4.7H2O0.02%,pH为9.0。在该条件下,菌株LZ10产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的酶活可达892.86u/mL酶液。

环状糊精葡萄糖基转移酶的性质及环糊精的转化条件

由嗜碱芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＫ２３１产生的环状糊精葡萄糖基转移酶（ＣＧＴａｓｅ）经变性淀粉吸附初步纯化后，酶活性最适ｐＨ为６．５－８．０；最适温度６０℃；典型生物抑制剂，如苯甲基磺氟酸酯（ＰＭＳＦ）、对氯高汞苯甲酸（ＰＣＭＢ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）等不能抑制ＣＧＴａｓｅ的活性；而一些金属离子如Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋等对ＣＧＴａｓｅ活性有较强抑制作用。以５％玉米淀粉为底物，酶用量４００ｕ／克作转化试验，１２ｈ时环糊精产量可达３３．５％。产品经质谱分析表明为β─环糊精。

浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶的克隆与表达

目的获取浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶基因并在大肠杆菌中表达。方法构建浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组菌株。经42℃诱导后,检测酶活性。结果浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶在大肠杆菌中成功表达,表达量达3 U/mL。结论浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶可以在大肠杆菌中高效表达。

环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,V_(C))和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明:此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度37℃,底物比例3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到12.68 g/L;当糖基供体为麦芽糊精时,底物浓度为30 g/L,反应pH5.0,反应温度37℃,底物比例4/2,蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为30 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到4.96 g/L。在最适条件下,AA-2G的产量分别是未优化反应条件下的18.93倍和7.40倍。经动力学分析发现可溶性淀粉作为糖基供体的催化效率高于麦芽糊精,因此,可溶性淀粉作为糖基供体比麦芽糊精更具有优势,合成得到AA-2G的产量更高。本研究成功将重组CGTase-T1用于AA-2G的合成,通过优化酶法合成的反应条件,使AA-2G的产量得到了大幅提高,为实现AA-2G的工业生产提供参考意义。

一株β-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌的筛选与发酵条件研究

从明阳淀粉厂周围的土壤中分离出一株产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的野生菌株。该野生菌株的酶活为634.37 U/mL,经UV和LiCl的初步诱变以及摇瓶产酶条件的优化后酶活达到了1530.61 U/mL。适宜的产酶条件为:0.5%可溶性淀粉和0.5%酵母膏分别作为碳源和氮源,装量50ml/250ml、转速250r/min、pH8.0、适宜温度35℃、接种量2%、发酵周期3d。

环状糊精和环状糊精糖基转移酶的研究概况

随着有关糖类物质研究的发展,环状糊精及其糖基转移酶的研究也进展很快。尤其近几年国内外许多科学家研究环状糊精糖基转移酶产生菌的筛选,酶的生产及其性质,环状糊精的生产和应用等方面有较大的进展。环状糊精广范应用于医学、制药、食品、农业等领域。现将有关研究情况归纳如下:

β-环糊精葡萄糖基转移酶突变基因的表达及突变酶酶学性质分析

通过对已构建的β-CGTase质粒载体采用一步PCR法进行大片段基因的定点突变,得到三个带有突变位点的质粒载体,并将其进行转化得到突变菌株。分析突变酶的酶学性质并与β-环糊精葡萄糖基转移酶比较,结果表明突变酶酶活力提高到原酶活力的1.6倍以上,且突变酶作用的最适温度60℃、最适p H6.0、在60℃下和p H5~8范围内均非常稳定,经方差分析突变酶与原酶的酶学性质差异不显著（p〉0.05）,但是酶活力差异显著（p〈0.05）。