DNA损伤应答中环状GMP-AMP合成酶的UFMylation修饰潜在作用

为探究环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthetase,cGAS)翻译后修饰参与DNA损伤应答的潜在作用,转染HeLa细胞和HEK-293T细胞,设置未处理组和Etoposide处理组。基于Western blot和免疫荧光染色,确定HeLa细胞质粒转染效率、Etoposide处理前后的DNA损伤效果、DNA损伤前后cGAS的细胞定位情况。采用免疫共沉淀和Western blot检测HEK-293T细胞cGAS的表达及UFMylation修饰。实验结果显示,HeLa细胞稳定表达cGAS,Etoposide处理可造成明显DNA损伤,未处理组cGAS富集于细胞质,处理组cGAS富集于细胞核。HEK-293T细胞稳定表达转染质粒,同时发现UFMylation修饰的cGAS。因此,cGAS参与DNA损伤应答且可能通过UFMylation修饰调控,为翻译后修饰视角研究DNA损伤应答提供理论参考。

环状GMP-AMP合成酶高表达对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨环状GMP-AMP合成酶(cGAS)高表达对乳腺癌MCF7细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。方法:构建稳定高表达cGAS的慢病毒载体并转染MCF7细胞;转染后细胞分别培养12 h,24 h,48 h,72 h,每组实验重复三次,采用MTT检测cGAS对MCF7细胞增殖的影响;transwell法检测高表达cGAS对MCF7细胞迁移能力的影响;蛋白免疫印迹(Western blot)法分析EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达情况。结果:与对照组比较,cGAS上调后MCF7细胞增殖能力显著增强(P<0.05);细胞形态学观察显示cGAS上调后诱导MCF7细胞EMT发生,细胞形态由鹅卵石样变为梭形;transwell实验结果显示,cGAS上调导致MCF7细胞迁移能力增强(P<0.05);Western blot结果表明,cGAS上调后上皮标记蛋白E-cadherin表达下降(P<0.05),间质标记蛋白N-cadherin表达增加(P<0.05)。结论:cGAS上调可增强乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,诱导乳腺癌细胞EMT发生。

灯盏乙素通过环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症

目的探讨灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症的影响。方法培养BV-2小胶质细胞系,将BV-2小胶质细胞分为对照组(Ctrl)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)抑制剂RU320521(RU.521)组、LPS组、LPS+RU.521组、LPS+灯盏乙素预处理(LPS+S)组、LPS+S+RU.521组,共6组。Western blotting及免疫荧光双标染色法检测并观察BV-2小胶质细胞中cGAS、干扰素基因刺激因子(STING)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、PYD结构域蛋白3(NLRP3)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化(n=3)。结果Western blotting和免疫荧光双标染色均显示,与对照组相比,LPS诱导后,BV-2小胶质细胞中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+S组中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。使用cGAS通路抑制剂RU.521后显示了与灯盏乙素预处理组相似的作用效果。此外,NF-κB在各组的变化不明显(P>0.05)。结论灯盏乙素干预抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应,可能与cGAS-STING信号通路有关。

桂枝芍药知母汤抑制cGAS/STING/NF-κB通路对类风湿关节炎大鼠炎症活动的影响

目的基于环状GMP-AMP合成酶(cGAS)/干扰素基因刺激因子(STING)/核因子-κB(NF-κB)通路探讨桂枝芍药知母汤对类风湿关节炎大鼠炎症活动的影响及机制。方法取70只Wistar大鼠,随机选择10只作为正常组,其余60只大鼠制备胶原诱导性关节炎模型。将造模成功大鼠随机分为模型组、甲氨蝶呤组、雷公藤组及桂芍知母汤低、中、高剂量组,每组10只。甲氨蝶呤组给予0.104 mg/mL的甲氨蝶呤片混悬液灌胃,1次/周,其余时间每天给予蒸馏水灌胃1次;雷公藤组给予0.625 mg/mL的雷公藤多甙片混悬液灌胃,桂芍知母汤低、中、高剂量组分别给予0.958 g/mL、1.916 g/mL、2.874 g/mL的桂枝芍药知母汤灌胃,正常组、模型组给予蒸馏水灌胃,均1次/d。各组均干预4周。测量各组大鼠干预1,2,3,4周末足趾肿胀程度,并计算关节炎指数(AI);末次干预结束后,ELISA法检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,Western blot法检测滑膜组织中cGAS、STING、NF-κB p65、IκBα蛋白表达情况。结果干预1,2,3,4周末,模型组大鼠的关节肿胀度均明显高于正常组(P均<0.05);随时间推移,模型组大鼠的关节肿胀度逐渐增加,各药物干预组大鼠的关节肿胀度有不同程度的降低,其中桂芍知母汤中剂量组干预4周末的关节肿胀度明显低于模型组(P<0.05)。干预1周末,各组间AI评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05);干预2,3,4周末,桂芍知母汤高剂量组AI评分均明显低于模型组和桂芍知母汤低剂量组(P均<0.05),且桂芍知母汤高剂量组干预2周末的AI评分明显低于雷公藤组(P<0.05);干预3周末,甲氨蝶呤组、桂芍知母汤中剂量组AI评分均明显低于模型组(P均<0.05);干预4周末,甲氨蝶呤组、雷公藤组、桂芍知母汤中剂量组、桂芍知母汤低剂量组AI评分均明显低于模型组(P均<0.05)。与正常组比较,模型组血清IL-1β、IL-17、TNF-α水平及滑膜组织中cGAS、STING、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),滑膜组织中IκBα蛋白相对表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,各药物干预组血清IL-1β、IL-17、TNF-α水平及滑膜组织中cGAS、STING、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),滑膜组织中IκBα蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。桂芍知母汤高剂量组和甲氨蝶呤组血清IL-1β、IL-17和TNF-α水平及滑膜组织中cGAS、STING、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于桂芍知母汤低剂量组(P均<0.05),滑膜组织中IκBα蛋白相对表达量均明显高于桂芍知母汤低剂量组(P均<0.05)。结论桂枝芍药知母汤可明显减轻类风湿关节炎大鼠关节肿胀和关节炎症,机制可能与抑制cGAS/STING/NF-κB通路,降低炎症因子水平有关。

环状脂肽的结构多样性及结构改造策略

环状脂肽是由芽孢杆菌产生的一种次级代谢产物,具有较好的表面活性、生物活性及对环境友好等特点,在食品、医药和石油工业等领域都有广泛的应用。环状脂肽的结构主要包含亲水的肽环结构和亲油的脂酰基结构两部分,由于脂肪酸链长度、构型及肽环上氨基酸种类和位置的变化,环状脂肽具有多种同系物。目前,环脂肽主要包含芬芥素(fengycins)、表面活性素(surfactins)和伊枯草菌素(iturins)三大家族,其中surfactins具有更强的表面活性,而iturins和fengycins具有更好的抗真菌活性。本文对3种环状脂肽的结构多样性及性质进行了归纳,详细解析了肽合成及脂酰基合成的相关代谢途径,对目前关于脂肽的结构修饰相关研究进行了综述和总结,并对后期研究方向进行了展望:解决肽环修饰带来的低产问题及找到更好的定向修饰脂酰基结构的方法,是未来脂肽结构改造需要突破的核心问题。

灯盏乙素对大鼠脑缺血后小胶质细胞cGAS/STING/NLRP3信号轴的调控

目的:探讨灯盏乙素对大鼠脑缺血后小胶质细胞环状GMP-AMP合成酶(cGAS)/干扰素基因刺激蛋白(STING)轴及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达的影响。方法:将36只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham)、大脑中动脉栓塞(MCAO)、MCAO+灯盏乙素干预组(MCAO+S)。开颅法制备大鼠脑缺血模型,分别用HE染色观察大鼠脑组织病理性变化,免疫荧光染色检测大鼠小胶质细胞中cGAS、STING、NLRP3表达的变化,Western Blot检测大鼠缺血后3 d脑内cGAS、STING、NLRP3蛋白表达的变化。结果:HE染色显示,灯盏乙素干预后,缺血区皮质中神经细胞数量减少、分布紊乱、细胞间隙大等病理现象较MCAO组明显改善;免疫荧光染色显示MCAO+S组中小胶质细胞的激活受到抑制,cGAS、STING、NLRP3在小胶质细胞中的表达水平下降;Western Blot结果显示,MCAO组中cGAS、STING、NLRP3表达显著增加,灯盏乙素干预后,上述指标明显下降。结论:灯盏乙素可抑制大鼠脑缺血后小胶质细胞中cGAS/STING/NLPR3的过表达,减轻小胶质细胞介导的神经炎症。

牛环鸟苷酸-腺苷酸合成酶的可溶性原核表达与生物酶活性分析

为了体外获得具有生物学活性的牛环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)及其催化合成产物2’3’-cGAMP,首先克隆了牛cGAS基因并分析其氨基酸结构,随后构建了其可溶性原核表达载体p ET-28a-SUMO-bcGAS,并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析对表达的重组蛋白进行初步纯化后切除SUMO标签蛋白,再用亲和层析进一步纯化,将获得的bcGAS蛋白用于体外酶促反应合成第二信使分子2’3’-cGAMP,并利用ELISA方法和反向高效液相色谱-质谱分析2’3’-cGAMP的产量、纯度和分子结构。结果显示,成功构建了pET-28a-SUMO-bcGAS载体,通过优化诱导条件实现了目的蛋白的可溶性表达,同时,酶促合成反应证实bcGAS具有生物活性,最后,通过ELISA和反向高效液相色谱-质谱分析2’3’-cGAMP结构正确、产量纯度较高,这为后续2’3’-cGAMP的抗病毒、抗肿瘤药物和免疫调节剂的开发奠定了基础。

寻常型银屑病患者外周血线粒体DNA检测及其临床意义

目的:分析寻常型银屑病患者外周血线粒体DNA(mtDNA)水平,并探讨其在疾病中的作用机制。方法:收集28例寻常型银屑病患者和28例健康对照者外周血,实时荧光定量PCR检测血浆mtDNA表达。分离外周血单个核细胞,实时定量PCR检测环状GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)和干扰素基因刺激物(stimulator of interferon gene,STING)mRNA表达水平。外周血单个核细胞与mtDNA共培养,ELISA检测上清液白细胞介素(interleukin,IL)-23、IL-17、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)浓度。结果:与健康对照组相比,银屑病组外周血mtDNA相对表达显著升高[(2.34±0.81)vs(1.18±0.25),P<0.001],且与银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)评分呈正相关(r=0.693,P<0.001)。与健康对照组相比,银屑病组外周血单个核细胞cGAS和STING mRNA相对表达均显著上升(P均<0.001)。与mtDNA共培养后,单个核细胞IL-23、IL-17、IFN-γ分泌显著增加(P均<0.001),且与PASI评分均呈正相关(r分别为0.647,0.585,0.492,P均<0.01)。结论:银屑病患者外周血mtDNA异常升高,可能通过活化免疫细胞cGAS/STING信号通路,参与银屑病疾病过程。

cGAS抑制剂对小鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用及其机制

目的观察cGAS抑制剂对小鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用,并基于自噬调节探讨相关机制。方法雄性C57BL/6小鼠18只,随机分为假手术组、模型组、实验组,每组6只。模型组、实验组采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型,实验组在再灌注前10 min腹腔注射5 mg/kg的cGAS抑制剂RU.521,假手术组分离大脑中动脉但不阻断。再灌注6 h后行HE染色、Nissl染色观察脑组织病理变化,Western blotting法检测脑组织中的cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白,免疫荧光法检测凋亡细胞并计算凋亡率。结果与假手术组相比,模型组神经元数量减少,细胞固缩,实验组上述改变减轻。模型组脑组织中cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白相对表达量及细胞凋亡率高于假手术组,实验组cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表达及细胞凋亡率低于模型组(P均<0.05)。结论cGAS抑制剂预处理可减轻小鼠脑缺血再灌注损伤,其机制可能与调节自噬相关蛋白表达有关。

cGAS-STING通路异常激活及其抑制剂在免疫和炎症疾病中的研究进展

cGAS-STING通路是针对多种类型病原体进行免疫防御的主要途径之一,环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)通过识别细胞质的DNA分子,催化生成第二信使cGAMP(cyclic GMP-AMP)与干扰素基因刺激因子(STING)结合,诱导产生I型干扰素(IFN-I),激活机体先天免疫系统。cGAS-STING通路的适当激活有助于机体实现自我保护,因此,近年来STING激动剂在肿瘤免疫治疗的研究中引起了广泛关注,一些候选药物已进入临床研究,用于多种肿瘤治疗。与此同时,cGAS-STING通路异常激活会导致自身免疫性疾病的发生,获得了药物研究者的广泛关注并积极开发其抑制剂。该文总结了cGAS-STING通路的机制和调控位点,概述了cGAS-STING通路相关的免疫和炎症疾病及其抑制剂的研究进展。

益母草碱对结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长和免疫功能的影响

目的 探讨益母草碱对结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长和免疫功能的影响。方法 C57BL/6小鼠建立结肠癌荷瘤小鼠模型,造模后的小鼠随机分为对照组(0.9%NaCl)、低剂量实验组(180 ng·g^(-1)益母草碱)、高剂量实验组(360 ng·g^(-1)益母草碱)、高剂量+空载组(360 ng·g^(-1)益母草碱+空载质粒)、高剂量+cGAS敲低组(360 ng·g^(-1)+cGAS siRNA质粒)。分组处理后测定肿瘤体积与质量,以免疫组化染色检测肿瘤组织环状GMP-AMP合成酶(cGAS)、干扰素基因刺激因子(STING)相对阳性表达及CD4^(+)T与CD8^(+)T阳性细胞数,以细胞计数试剂盒8法检测小鼠CD4^(+)T与CD8^(+)T细胞对肿瘤细胞杀伤率。结果 对照组、高剂量实验组、高剂量+空载组、高剂量+cGAS敲低组小鼠的肿瘤体积分别为(1 088.32±70.82)、(468.20±24.28)、(480.01±23.78)和(998.99±32.84)mm~3,cGAS相对阳性表达分别为1.00±0.00、5.18±0.73、5.30±0.80和1.12±0.46,STING相对阳性表达分别为1.00±0.00、5.64±0.81、5.48±0.75和1.14±0.50,CD4^(+)T阳性细胞数分别为(40.25±5.82)、(118.64±15.30)、(113.25±16.65)和(48.74±7.10)个,CD8^(+)T阳性细胞数分别为(49.76±6.12)、(143.68±16.80)、(135.75±17.42)和(57.01±8.24)个。高剂量实验组、高剂量+空载组的上述指标与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);高剂量+cGAS敲低组的上述指标与高剂量实验组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 益母草碱可通过激活cGAS-STING信号而增强结肠癌荷瘤小鼠淋巴细胞增殖能力,抑制小鼠肿瘤生长。

cGAS-STING信号通路在疾病中的作用

环GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)是一种新发现的DNA感受器。近年来,越来越多的研究表明它介导的干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, cGAS-STING)信号通路参与了多种疾病的发生与发展。深入了解cGAS-STING信号通路在疾病中的作用及机制将有助于认识和治疗相关疾病。本文就cGAS-STING信号通路的激活过程及其在感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和呼吸系统疾病中的相关作用与机制展开综述,为上述疾病的预防与治疗提供新思路。

cGAS-STING通路在神经退行性疾病中的作用

外来或自身错位的核酸通过激活胞质DNA传感器环GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)并结合其下游信号效应干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)触发先天免疫反应。许多神经退行性疾病都显示出激活的炎症表型,靶向cGAS-STING通路的小分子调节剂成为治疗大多数涉及型干扰素水平升高和促炎细胞因子增加的神经退行性疾病的关键。本文总结了cGAS-STING通路在多种神经退行性脑部疾病,如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)以及肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等中发挥的重要功能机制的最新研究进展,并讨论cGAS-STING小分子调节剂如cGAS抑制剂和STING抑制剂在这些疾病中可能的治疗作用,为大多数神经退行性疾病的药物治疗提供新策略。