circRNA CPSF6核内转移促进同型半胱氨酸诱导的滋养细胞凋亡

目的探讨环状RNA剪切及多聚腺苷酸化特异因子6(circRNA CPSF6)在同型半胱氨酸(Hcy)致滋养细胞凋亡中的作用及机制。方法体外培养HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞,分为对照组(0 mmol/L Hcy处理)与1 mmol/L Hcy处理组。采用免疫荧光细胞化学染色检测滋养细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达,Western blot法检测caspase-3蛋白水平;实时定量PCR检测circRNA CPSF6的mRNA表达水平;同时,运用小干涉RNA(siRNA)技术敲低滋养细胞circRNA CPSF6表达,Western blot法检测细胞caspase-3、caspase-9、B细胞淋巴瘤分子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)表达;实时定量PCR检测circRNA CPSF6在Hcy处理前后滋养细胞胞质/胞核中的表达水平。结果与对照组相比,Hcy处理组caspase-3表达明显增加,circRNA CPSF6 mRNA表达上调;敲低circRNA CPSF6后,caspase-3表达降低,线粒体凋亡途径被抑制;正常培养的滋养细胞中circRNA CPSF6在胞质大量表达,而给予Hcy处理后,circRNA CPSF6主要在胞核表达。结论通过circRNA CPSF6核内转移激活线粒体凋亡途径促进Hcy诱导的滋养细胞凋亡。

CircCpsf6在N2a细胞中对细胞活力的抑制作用及其结合的蛋白功能富集分析

目的探讨CircCpsf6在N2a细胞中对细胞活力的影响,同时对CircCpsf6结合蛋白进行功能富集分析,预测CircCpsf6影响细胞活力的分子机制。方法在N2a细胞中转染CircCpsf6的siRNA或过表达质粒,对CircCpsf6进行敲减或过表达,用CCK-8法检测细胞活力。在CircCpsf6的接口处设计特异性探针,进行下拉实验,即CircCpsf6的反义纯化实验。经过磁珠吸附,蛋白的洗脱、纯化,蛋白的质谱检测,得到CircCpsf6可能结合的蛋白。利用在线网站STRING对这些蛋白之间可能存在的相互作用进行预测,同时利用在线网站DAVID进行蛋白功能富集分析。结果在N2a细胞中,CircCpsf6能够被有效的敲减或过表达(P<0.01),敲减CircCpsf6后,细胞活力上升(P<0.01);过表达CircCpsf6后,细胞活力下降(P<0.05)。经过CircCpsf6的反义纯化实验,发现CircCpsf6可能与385个蛋白结合。GO分析和KEGG富集分析提示CircCpsf6可能通过结合蛋白影响细胞的增殖或者凋亡,从而影响细胞活力。结论CircCpsf6能够抑制N2a细胞的细胞活力。CircCpsf6可能通过结合G6pdx、Pcx、Csl影响细胞增殖,通过结合2210010C04Rik、Try10、Gm2663影响细胞凋亡。