凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在C反应蛋白诱导人脐静脉内皮细胞组织因子表达中的作用

目的研究凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-type oxidized LDL receptor1,LOX-1)在C-反应蛋白(c-reactive protein,CRP)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法用人重组质粒pTracer CMV2-CRP转染HUVECs细胞,分正常对照组、空质粒GFP组和CRP-GFP组(n=3),RT-PCR、Western blot检测TF、LOX-1 mRNA和蛋白表达。Western blot检测各组P-ERK1/2、T-ERK1/2、P-JNK、T-JNK蛋白表达。CRP-GFP组分别加LOX-1阻断剂、ERK1/2阻断剂(U0126)、JNK阻断剂(SP600125),Westernblot检测TF蛋白。结果用表达人CRP的质粒转染HUVECs显著增加LOX-1 mRNA和蛋白表达[(0.70±0.03)vs(0.24±0.01),(0.661 6±0.020 0)vs(0.255 8±0.040 0),P<0.05]、TF的mRNA和蛋白表达[(0.442±0.040)vs(0.146 0±0.030 0),(0.727 4±0.020 0)vs(0.217 4±0.020 0),P<0.05]。CRP启动了ERK1/2 MAPK,未启动JNKMAPK。CRP上调TF表达被ERK1/2阻断剂而非JNK阻断剂阻断.抗LOX-1的中和抗体显著减少CRP诱导的TF mRNA和蛋白表达[(0.264 0±0.030 0)vs(0.442 0±0.040 0),(0.324 4±0.040 0)vs(0.727 4±0.020 0),P<0.05]。结论CRP诱导HUVECs细胞LOX-1表达上调,并通过LOX-1受体这一新途径上调TF表达,且CRP通过ERK1/2 MAPK信号途径非JNK MAPK途径上调了HUVEC细胞TF的表达。

凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列反义核酸在血管内皮细胞中的作用研究

目的探讨TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HU-VECs)生长活性、增殖活性影响。方法构建TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA真核表达载体(pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ),经双酶切、测序及Western blot鉴定后,转染HUVECs。采用MTT法检测转染后HUVECs活性改变,流式细胞仪检测转染后HUVECs周期变化,透射电镜观察转染后HUVECs形态学改变。结果构建的pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ经鉴定后转染HUVECs,MTT法检测所得HUVECs OD值较未转染组、pcDNA3.1-空载体转染组升高(均P<0.01);流式细胞仪检测结果显示:pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ转染HUVECs后S+G2(%)较未转染组、pcDNA3.1-空载体转染组S+G2(%)延长(均P<0.01);透射电镜结果显示:pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ转染后HUVECs核仁相对增多。结论TSP-1反义RNA能够促进HUVECs增殖和生长。

血栓调节蛋白、细胞内黏附分子-1及氧化低密度脂蛋白内皮受体-1在糖尿病大鼠肾皮质的基因表达

目的采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法逆转录链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾皮质中血栓调节蛋白(TM)、细胞内黏附分子-1(ICAM-1)及氧化低密度脂蛋白内皮受体-1(LOX-1)基因的mRNA表达,并采用半定量法测定其mRNA含量,以探讨其在糖尿病肾病的发生、发展中可能参与的机制。方法选择18 只成年SD大鼠,注射STZ制成糖尿病模型,其中4只给予注射胰岛素作为治疗对照(TC)组,其余为糖尿病 (DM)组;另选4只SD大鼠作为正常对照(NC)组。每4周测定尿白蛋白定量,14周取肾皮质匀浆后采用RT- PCR法检测其中TM、ICAM-1及LOX-1的mRNA表达,并采用半定量法测定其含量变化。结果 DM组与NC 组肾皮质内TM、ICAM-1及LOX-1 mRNA含量的差异有显著性(P<0．05),与TC组的差异无显著性(P>0．05); DM组TM、ICAM-1及LOX-1的含量与尿白蛋白定量呈显著正相关(r=0．703、0．624、0．851,P<0．01、0．05和 0．01)。结论 TM、ICAM-1及LOX-1参与了糖尿病肾病的发生、发展。

沉默血小板反应蛋白-1基因对亚溶解型C5b-9诱导肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响

目的研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响。方法设计合成针对TSP-1基因4个靶点的小发夹RNA(small hair RNA,shRNA),并构建相应的表达质粒,筛选沉默效率最佳的TSP-1shRNA(shTSP-1)后,将shTSP-1转染体外培养的大鼠GMC,再给予sublytic C5b-9刺激。以Westernblot检查TSP-1、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)的表达情况。另用ELISA法测定培养上清中总转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和活化TGF-β1的含量。结果核酸序列分析证明,4种TSP-1shRNA重组质粒均构建成功。Western blot实验证实,构建的shTSP-1-3(Thbs1-3)具有最佳的沉默效率。将shTSP-1-3转染大鼠GMC后,在沉默TSP-1基因表达的同时,能明显抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化及细胞外基质(FN和collagenⅣ)的合成。结论 TSP-1基因表达在sublytic C5b-9刺激大鼠GMC诱导TGF-β1活化及ECM分泌的过程中,发挥了重要的促进作用。

环状RNA ATP2B1靶向miR-452-5p降低胃癌细胞系的增殖和侵袭

目的探讨环状RNA circATP2B1对胃癌细胞增殖和侵袭的影响及其可能的分子机制。方法收集2018年7月至2021年2月福建医科大学附属泉州第一医院胃肠肝胆外科行手术切除并病理学诊断的44例胃癌组织标本及癌旁组织标本。选取4株胃癌细胞系(SGC7901、HS-746T、MGC803、BGC823)和正常胃黏膜上皮细胞系(GES-1)。RT-qPCR检测胃癌组织和细胞系中circATP2B1表达。将circATP2B1表达最低的胃癌细胞分为对照组(转染阴性对照质粒)和实验组(转染circATP2B1过表达质粒)。分别采用MTT法和Transwell小室法检测各组胃癌细胞的增殖活性和侵袭能力。生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析circATP2B1可能的作用机制,RT-qPCR和Western blot检测circATP2B1下游基因的表达。结果胃癌组织circATP2B1表达量显著低于癌旁组织(0.92±0.08 vs 3.62±0.23,P<0.01)。胃癌细胞系circATP2B1表达量均显著低于GES-1细胞(P<0.01),其中以HS-746T细胞的表达量最低(P<0.01)。与对照组相比,实验组HS-746T细胞的增殖活性显著降低(P<0.05),侵袭能力显著下降(P<0.01)。生物信息学和双荧光素酶报告基因实验显示circATP2B1可靶向结合miR-452-5p(P<0.01),miR-452-5p可靶向结合原钙黏附蛋白9(PCDH9)(P<0.01)。与对照组比较,实验组HS-746T细胞miR-452-5p表达显著下降(1.00±0.04 vs 0.24±0.05,P<0.01),PCDH9基因表达显著上升(P<0.01)。结论circATP2B1在胃癌组织和细胞系中低表达,circATP2B1通过靶向结合miR-452-5p正调控PCDH9基因表达,进而降低胃癌HS-746T细胞增殖和侵袭能力。

长链非编码RNA alpha-2-巨球蛋白反义RNA 1靶向微小RNA-106b-5p调控氧化型低密度脂蛋白诱导的人脑微血管内皮细胞损伤

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)alpha-2-巨球蛋白反义RNA 1(A2M-AS1)靶向微小RNA(miR)-106b-5p对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脑微血管内皮细胞损伤的影响。方法用ox-LDL诱导人脑微血管内皮细胞设为ox-LDL组,正常培养细胞为对照(Ctrl)组;A2M-AS1过表达(pcDNA-A2M-AS1组)、空载体(pcDNA组)、miR-106b-5p抑制剂(anti-miR-106b-5p组)、阴性对照(anti-miR-NC组)、pcDNA-A2M-AS1与对照mimic NC(miR-NC组)、pcDNA-A2M-AS1与miR-106b-5p模拟物(miR-106b-5p mimics组)转染细胞后加ox-LDL处理,n=9;Real-time PCR检测A2M-AS1与miR-106b-5p表达;试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平;流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测A2M-AS1与miR-106b-5p靶向关系;Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白表达量。结果与Ctrl组比较,ox-LDL组A2M-AS1表达水平、SOD和CAT活性、Bcl-2蛋白水平降低,miR-106b-5p表达水平、MDA水平、凋亡率、Bax蛋白水平升高(P<0.05);过表达A2M-AS1或干扰miR-106b-5p降低ox-LDL诱导细胞后MDA水平、凋亡率与Bax蛋白水平,升高SOD、CAT活性和Bcl-2蛋白水平(P<0.05);A2M-AS1靶向miR-106b-5p;上调miR-106b-5p逆转过表达lncRNA A2M-AS1对ox-LDL诱导的人脑微血管内皮细胞损伤的作用。结论A2M-AS1通过靶向miR-106b-5p减轻ox-LDL诱导的人脑微血管内皮细胞损伤。

微小RNA对心肌细胞C反应蛋白功能水平的调节

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)基因调节机制对冠心病标志性分子C反应蛋白(CRP)的调节。方法以大鼠心肌细胞H9c2(2-1)为实验对象,在培养中进行miR312的增强和抑制处理:加入Pre-miR-132作为miR-132增强剂,Pre-miR miRNA前体分子阴性对照1号作为增强处理的对照;加入Anti-miR-132作为miRNA-132抑制剂,Anti-miR miRNA抑制剂阴性对照1号作为抑制处理的对照。用iFect转染后培养48 h,收集细胞进行CRP的蛋白免疫印迹杂交。结果大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)在增强剂Pre-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平明显下降(t-检验,P=0.013 21);与此同时,抑制剂Anti-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平出现了明显上升(t-检验,P=0.012 40)。结论微小RNA miR-132对大鼠心肌细胞CRP功能水平具有显著的调节作用,二者呈负相关关系。

系统性红斑狼疮患者外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值水平变化及联合诊断血栓事件的临床价值

目的:探究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血Ⅻ因子抗凝血酶复合物(FⅫa-AT)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、狼疮抗凝物(LA)比值水平变化及联合诊断血栓事件的临床价值。方法:选取邢台市人民医院SLE患者133例,根据是否发生血栓事件分为单纯SLE组(105例)与SLE合并血栓组(28例),另选同期健康体检人群102例作为对照组。比较3组患者临床资料、外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值水平,分析各外周血指标与SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分的相关性,分析SLE患者发生血栓事件的影响因素,评价各外周血指标诊断SLE合并血栓事件的价值。结果:SLE合并血栓组患者年龄≥60岁、高血压、有吸烟史的比例高于单纯SLE组和对照组(P<0.05);SLE合并血栓组SLEDAI评分、外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值水平均明显高于单纯SLE组和对照组,单纯SLE组明显高于对照组(P<0.05);SLE患者外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值与SLEDAI评分呈正相关(r=0.663、0.578和0.625);年龄、血压情况、吸烟史、外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值是SLE患者发生血栓事件的重要影响因素(P<0.05);外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值联合诊断AUC为0.881,95%CI为0.813-0.931,敏感度为82.14%,特异度为91.43%,优于各指标单独诊断(P<0.05)。结论:SLE患者外周血FⅫa-AT、TSP-1、LA比值水平变化与疾病活动度显著相关,联合诊断血栓事件价值较为可靠。

RNA干扰抑制肾小管上皮细胞TSP1表达和TGF-β1活化

血小板反应蛋白1(TSP1)是转化生长因子-β1(TGF-β1)体内重要的活化因子,而后者又是致肾小管间质纤维化的关键因素。观察了针对TSP1的小双链干扰RNA(siRNA-TSP1),抑制由血管紧张素II(AngII)诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化。将根据人TSP1基因序列设计的特异siRNA-TSP1转染人肾小管上皮细胞系(HK-2),利用Western印迹、RT-PCR、流式细胞仪及ELISA等方法,检测了TSP1、TGF-β1及其信号蛋白Smad2与p-Smad2、纤维连接蛋白(FN)和纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)的基因转录水平、蛋白质表达或蛋白质活性。结果显示,siRNA-TSP1能有效转染HK-2细胞,并以剂量依赖方式显著抑制TSP1的基因转录与合成;其对TGF-β1的合成影响较小,但能明显抑制TGF-β1的活化。此外siRNA-TSP1可阻抑TGF-β1依赖的Smad2磷酸化,减少细胞外基质FN以及PAI-1的合成。研究结果提示,由于TSP1是TGF-β1重要的内源性活化因子,故针对TSP1的RNA干扰能在体外有效抑制TSP1表达并相应调抑了TGF-β1的活化。

CircBACH1调节miR-101-3p/KPNA2轴对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究环状RNA BACH1(circBACH1)靶向微小RNA-101-3p(miR-101-3p)/核转运蛋白α2(KPNA2)轴对骨肉瘤(OS)细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:qRT-PCR法分析OS组织中circBACH1和miR-101-3p表达水平。双荧光素酶检测circBACH1和miR-101-3p及KPNA2和miR-101-3p的靶向关系。在OS细胞MG-63中转染相应质粒记为si-NC组、si-circBACH1组、si-circBACH1+anti-NC组、si-circBACH1+anti-miR-101-3p组、miR-NC组、miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA组、miR-101-3p mimics+KPNA2组。平板克隆检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞侵袭能力。Western blot法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、裂解的胱天蛋白酶-3(C-caspase-3)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达变化。小鼠移植瘤实验验证circBACH1对OS肿瘤生长及miR-101-3p/KPNA2的影响。结果:在OS组织中,circBACH1表达上调,miR-101-3p表达下调(P<0.05)。抑制circBACH1表达,可显著抑制OS细胞增殖与侵袭,诱导凋亡(P<0.05)。抑制miR-101-3p表达可促进OS细胞增殖与侵袭,抑制细胞凋亡(P<0.05)。miR-101-3p过表达可下调KPNA2表达,抑制OS细胞增殖与侵袭,诱导凋亡(P<0.05)。KPNA2过表达可以逆转过表达miR-101-3p对OS细胞增殖与侵袭的抑制作用(P<0.05)。小鼠移植瘤实验结果显示,抑制circBACH1表达,移植瘤体积及质量降低,miR-101-3p表达水平升高,KPNA2表达水平降低(P<0.05)。结论:circBACH1在OS组织中高表达,抑制circBACH1表达,可抑制OS细胞增殖与侵袭,诱导凋亡,其与调节miR-101-3p/KPNA2轴有关。

前列腺素E1对急性缺血损伤大鼠肾组织血栓调节蛋白表达的影响

探讨前列腺素E1(prostaglandin E1,PGE1)对肾缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury,IRI)大鼠血中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)水平和肾组织血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)表达的影响。健康Wistar大鼠80只随机分为空白对照组、假手术组、模型组、PGE1治疗组,每组按不同术后观察时间(1、3、6、24 h)均分。观察造模后其血清肌酐(creatinine,Cr)水平变化,采用流式细胞术和实时定量聚合酶链反应方法(Rt-PCR)同步监测ICAM-1表达水平和肾组织TM mRNA表达的动态变化。(1)模型组IRI损伤1 h,Cr水平虽然没有明显变化,但血清ICAM-1水平及肾小管坏死评分值已较假手术组明显增加(P均<0.05),并与肾组织TM mRNA表达升高的变化峰值时点相一致。(2)IRI损伤6 h,模型组和治疗组CrI、CAM-1水平均明显增高(P<0.05),但治疗组CrI、CAM-1水平及肾小管坏死积分值均明显低于模型组(P<0.05)。(3)肾组织中TM mRNA表达与肾小管损伤积分值呈现良好的相关性(r=0.69,P<0.01);且与ICAM-1水平的增加呈现良好的相关性(r=0.62,P<0.05)。(1)ICAM-1T、M mRNA表达增多,反映了IRI内皮细胞的损伤程度;(2)PGE1通过减少ICAM-1及TM mRNA水平的表达,阻抑凝血及炎症反应过程,保护内皮细胞,减轻肾组织损伤。

HSPA1A受HOTAIR/miR-590-3p轴调控促进I/R诱导的心肌梗死大鼠体内NF-κB介导的炎症反应

目的:探讨热休克70 kDa蛋白1A(HSPA1A)受长链非编码RNA(lncRNA)高温转录物反义RNA(HOTAIR)/微小RNA(miR)-590-3p轴的调控,对心肌缺血/再灌注(I/R)诱导的急性心肌梗死大鼠模型的调控作用。方法:建立大鼠心肌I/R损伤模型,将SD大鼠随机分为6组,分别为假手术组、I/R组、I/R联合siRNA沉默的HSPA1A组(I/R+si-HSPA1A组)、I/R联合siRNA沉默的HOTAIR组(I/R+si-HOTAIR组)、I/R联合si-HSPA1A的阴性对照组(I/R+si-NC组)、I/R联合siRNA沉默的HOTAIR的阴性对照组(I/R+si-NC2组)。建立H9C2细胞缺氧/复氧(H/R)模型,将H9C2细胞随机分为Ctrl组、H/R组、H/R联合si-HOTAIR组(H/R+si-HOTAIR组)、H/R联合si-HOTAIR和过表达HSPA1A组(I/R+si-HOTAIR+pc-HSPA1A组)4组。将常规培养的H9C2细胞分为miR-590-3p的拟似物组(mimic组)、mimic阴性对照组(mimic-NC组)、si-NC2组和si-HOTAIR组4组。用苏木素-伊红(HE)染色进行心肌组织病理学检查。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测心肌组织中肌酸激酶MB(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达以及血清中白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测H9C2细胞的活力。用Western blot分析HSPA1A、核因子-κB(NF-κB)P65、磷酸化的NF-κB P65(p-NF-κB P65)、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。用实时定量PCR(RT-qPCR)法分析HOTAIR和miR-590-3p的表达。利用双荧光素酶报告实验检测miR-590-3p与HSPA1A的3′非翻译区(UTR)以及HOTAIR与miR-590-3p的结合作用。结果:与假手术组比,I/R诱导后明显增加了心肌组织损伤和炎症(均P<0.05)。与I/R+si-NC组比,I/R+si-HSPA1A组的HSPA1A、NF-κB P65、p-NF-κB P65、IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平都下调(均P<0.05),缓解了心肌损伤和炎症反应。与假手术组比,I/R诱导后明显增加了HOTAIR表达并下调了miR-590-3p的表达(均P<0.05)。与I/R+si-NC2组比,I/R+si-HOTAIR组的HSPA1A、NF-κB P65、p-NF-κB P65、IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平都下调(均P<0.05),miR-590-3p的表达水平上调(P<0.05),缓解了心肌损伤和炎症反应。与H/R组比,H/R+si-HOTAIR组上调了H/R诱导下的H9C2细胞的增殖率(P<0.05),而H/R+si-HOTAIR+pc-HSPA1A组的细胞增殖率明显低于H/R+si-HOTAIR组(P<0.05)。与H/R组比,H/R+si-HOTAIR组H/R诱导的H9C2细胞中HOTAIR、HSPA1A、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著降低(均P<0.05),而H/R+si-HOTAIR+pc-HSPA1A组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达则显著增加(均P<0.05)。双荧光素酶报告实验检测发现HSPA1A的3′-UTR可直接结合miR-590-3p(P<0.05),且在H9C2细胞中,与mimic-NC组比,mimic组中的HSPA1A蛋白表达明显下调(P<0.05)。另外,HOTAIR也可直接结合miR-590-3p(P<0.05)。在H9C2细胞中,与si-NC2组相比,si-HOTAIR组的miR-590-3p表达水平上调(P<0.05)。结论:HSPA1A受HOTAIR/miR-590-3p轴调控促进I/R诱导的心肌梗死大鼠体内NF-κB介导的炎症反应。

缺氧后内皮细胞早期生长反应因子-1活化的信号机制

目的观察缺氧对内皮细胞早期生长反应因子(Egr-1)表达的影响及晚期糖基化终末产物(AGEs)及其受体(RAGE)对上述效应的可能调控机制。方法以培养小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)为模型,根据缺氧时间和缺氧前预处理方式,分为不同缺氧时间组[缺氧0(对照组),5,10,15,30,60,120min组]、anti-AGE预处理组、可溶性RAGE(sRAGE)预处理组和蛋白激酶C(PKC)β抑制剂组,实时定量PCR法检测缺氧后Egr-1mRNA含量、ELISA法检测细胞裂解液中AGEs含量、蛋白印迹法检测细胞膜蛋白中PKC各异构体的活化。结果缺氧15min组Egr-1mRNA表达上调,为对照组的(14.13±0.77)倍(P=0.0000);缺氧10～60min内皮细胞裂解液中AGEs堆积;缺氧15min组MAECs膜蛋白中PKCβⅡ含量为(30.57±1.86),显著高于对照组的含量(9.22±1.05)(P=0.002);anti-AGE、sRAGE和PKCβ抑制剂预处理减少缺氧诱导的Egr-1 mRNA表达上调(P=0.0000);anti-AGE和sRAGE预处理显著减少缺氧对PKCβⅡ的活化(P=0.0000)。结论急性缺氧诱导内皮细胞AGEs堆积、PKCβⅡ活化和Egr-1mRNA高表达,AGEs-RAGE和PKCβII信号参与急性缺氧后Egr-1诱导表达的调控。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

MIP-1α、DFR对老年卧床静脉血栓栓塞症的预测价值

目的探讨巨噬细胞炎性蛋白因子1-α(MIP-1α)、D-二聚体/纤维蛋白原(DFR)等指标在静脉血栓栓塞症(VTE)患者中的表达及其预测价值。方法选择65周岁以上疑似VTE患者129例,根据下肢加压超声(CUS)和CT肺血管造影(CTPA)将其分为非深静脉血栓形成组(DVT组)74例、深静脉血栓形成组(DVT组)34例、肺血栓栓塞症组(PTE组)21例。在抗凝治疗前采集患者新鲜血液标本,收集血常规及凝血指标,计算中性粒细胞计数/淋巴细胞计数比值(NLR);采用免疫比浊法测定血浆D-二聚体水平,凝固法测定血浆纤维蛋白原水平,计算D-二聚体/纤维蛋白原(DFR);采用ELISA法测定血清MIP-1α的水平,实时荧光定量法检测MIP-1αmRNA的表达量。通过绘制ROC曲线分析各指标对VTE的预测价值。结果 PTE组、DVT组D-二聚体、校正后D-二聚体、DFR水平均显著高于非DVT组(P<0.05);3组纤维蛋白原差异无统计学意义。DVT组、PTE组血清MIP-1α水平高于非DVT组,PTE组低于DVT组(P<0.05)。DVT组、PTE组MIP-1αm RNA的相对表达量均高于非DVT组(P<0.05)。D-二聚体、校正后D-二聚体、DFR、MIP-1α对老年VTE均有一定诊断价值,其中校正后D-二聚体(AUC=0.864)的诊断效能最高,DFR(AUC=0.853)的诊断效能与传统D-二聚体(AUC=0.851)相当;MIP-1α(AUC=0.739)对VTE的诊断价值一般。NLR对VTE的诊断无预测价值(P>0.05)。结论校正后D-二聚体是诊断老年VTE较为理想的辅助诊断指标,DFR、MIP-1α均可作为诊断VTE的方法,MIP-1α可能是评估静脉血栓形成及不稳定脱落的新指标。

circPVT1靶向调控miR-195-5p/SOX9轴影响结肠癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化

目的:探究环状RNA浆细胞瘤变体易位1(circPVT1)靶向调控微小RNA-195-5p(miR-195-5p)/性别决定区Y框蛋白9(SOX9)轴对结肠癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化(EMT)的影响。方法:体外培养人正常结肠上皮细胞NCM-460、人结肠癌细胞系(SW480、HCT116、HCT29、LOVO、SW620)至对数期,将SW480细胞分为对照组(正常培养SW480细胞不进行转染)、空载质粒组(转染空载质粒)、circPVT1沉默组[转染circPVT1小干扰RNA(siRNA)质粒]、miR-195-5p过表达组[转染miR-195-5p模拟物(mimics)质粒]、SOX9沉默组(转染SOX9 siRNA质粒)、circPVT1沉默+miR-195-5p低表达组(转染circPVT1 siRNA和miR-195-5p siRNA质粒)。各组转染相应质粒后培养48 h。荧光定量PCR法检测NCM-460细胞、人结肠癌细胞系(SW480、HCT116、HCT29、LOVO、SW620)和各组SW480细胞circPVT1、miR-195-5p、SOX9 mRNA的表达;噻唑蓝和流式细胞仪分别检测各组SW480细胞增殖和凋亡;蛋白印迹法检测各组SW480细胞SOX9、凋亡和EMT相关蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测circPVT1与miR-195-5p、miR-195-5p与SOX9的靶向关系。结果:与NCM-460细胞比较,SW480细胞、HCT116细胞、HCT29细胞、LOVO细胞、SW620细胞中circPVT1、SOX9 mRNA表达显著升高,miR-195-5p表达显著降低(P<0.05);其中,SW480细胞中circPVT1、SOX9 mRNA表达最高,miR-195-5p表达最低;故选择SW480细胞进行后续实验。与对照组和空载质粒组比较,circPVT1沉默组circPVT1、SOX9 mRNA及蛋白表达显著降低,miR-195-5p表达显著升高(P<0.05);miR-195-5p过表达组miR-195-5p表达显著升高,SOX9 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05);SOX9沉默组SOX9 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。与对照组和空载质粒组比较,circPVT1沉默组、miR-195-5p过表达组、SOX9沉默组细胞增殖率、Bcl-2、Vimentin蛋白表达显著降低,凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。与circPVT1沉默组比较,circPVT1沉默+miR-195-5p低表达组miR-195-5p、凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白表达显著降低,SOX9 mRNA及蛋白、细胞增殖率、Bcl-2、Vimentin蛋白表达显著升高(P<0.05)。circPVT1与miR-195-5p、miR-195-5p与SOX9存在靶向调控关系。结论:沉默circPVT1可以靶向上调miR-195-5p表达,抑制SOX9表达,进而抑制SW480细胞增殖和EMT进程,促进其凋亡。

反义RNA对胃癌细胞MT1-MMP基因表达和侵袭性的抑制作用

目的:膜研究膜型-1基质金属蛋白酶(MT1- MMP)反义RNA对人胃癌细胞BGC823靶基因表达和侵袭特性的影响方法:利用基因重组技术构建人MT1-MMP反义RNA真核表达载体,转染人胃癌细胞BGC823,应用RT-PCR、MTT、明胶酶谱和体外侵袭实验等方法观察人胃癌细胞BGC823转染前后,MT1-MMP mRNA表达水平、细胞生长、明教酶A活性及细胞体外侵袭能力等指标的变化.结果:成功构建了MT1-MMP反义RNA真核表达载体pasMMP14,将其转染胃癌细胞BGC823后,与阴性对照组相比,实验组MT1- MMP mRNA表达水平降低,抑制率为36%.转染48 h,明教酶A的活化受到了明显抑制.转染72 h,细胞增殖明显受抑(t=2.358,P<0.01 vs空白组:t=2.727 P<0.01 vs阴性组).实验组的穿膜细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组(t=5.744,P<0.01;t=5.695,P<0.01).结论:反义RNA对人胃癌细胞MT1-MMP基因表达和侵袭能力具有明显的抑制作用,MT1-MMP基因可作为胃癌抗侵袭治疗的分子靶点.

转化生长因子-β受体Ⅱ环状RNA通过调节核糖核酸结合蛋白2/胚胎致死性异常视觉样蛋白1促进前列腺癌发生发展

目的探讨前列腺癌细胞中转化生长因子-β受体Ⅱ环状RNA(circTGFBR2)调节核糖核酸结合蛋白2(PTBP2)/胚胎致死性异常视觉样蛋白1(ELAVL1)激活SMAD2信号途径促进前列腺癌发生发展。方法利用生物信息学方法, 寻找与circTGFBR2结合microRNA以及其他相关蛋白结合位点, 以及与PTBP2存在相互作用的RNA结合蛋白。PC3转染pcDNA3.1-circTGFBR2后, 实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circTGFBR2的表达。PC3细胞过表达circTGFBR2同时敲低微小RNA(microRNA, miR)-29b, 蛋白质印迹法(Western blot)检测ALK5、SMAD2及p-SMAD2表达。PC3分别转染pcDNA3.1-circTGFBR2及对照质粒后, 利用circTGFBR2特异性探针进行pulldown, 检测PTBP2与circTGFBR2的相互作用。过表达circTGFBR2与ELAVL1, 检测细胞上皮-间充质转化(EMT)的标志基因E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及ZMYM1表达, 以及Transwell检测细胞迁移。组间比较应用单因素方差分析。结果分析结果显示circTGFBR2存在多个miR-29b结合的位点, ALK5(又名TGFBR1)mRNA 3’端非编码区(3’UTR)同样存在miR-29b的结合位点, 并证实PTBP2与另一个RNA结合蛋白ELAVL1存在相互作用。用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激PC3细胞发现, circTGFBR2的表达高于对照组(1.83±0.02比1.03±0.02, F=2 832.200, P<0.01)。PC3分别转染pcDNA3.1-circTGFBR2及对照质粒后, RT-qPCR检测circTGFBR2的表达, 可见circTGFBR2组高于对照组(176.41±1.21比1.04±0.02, F=63 426.15, P<0.01)。应用miR-29b抑制剂或circTGFBR2处理细胞后ALK5的蛋白水平明显高于对照组, 应用miR-29b抑制剂同时过表达circTGFBR2后进一步增加ALK5的表达(分别为0.15±0.01、0.48±0.02、0.55±0.01、0.74±0.01, F=1268.314, P<0.01), 并且SMAD2(分别为1.14±0.02、1.28±0.02、1.42±0.01、1.5±0.25, F=4.852, P<0.01)和p-SMAD2(分别为0.18±0.02、0.36±0.01、0.65±0.01、0.94±0.02, F=1663.667, P<0.01)的磷酸化水平也呈相同趋势。Pulldown-MS实验, 多个蛋白质能与circTGFBR2结合, 并证实PTBP2与circTGFBR2相互作用。与对照组比较, 敲低前列腺癌细胞PTBP2或过表达circTGFBR2时, 间质标志基因Vimentin表达高于对照组, 而上皮样标志基因E-cadherin表达低于对照组, 当同时过表达circTGFBR2并敲低PTBP2会逆转上述结果(Vimentin分别为0.22±0.02、0.87±0.02、0.85±0.02、0.6±0.01, F=1319.52, P<0.01;E-cadherin分别为0.80±0.01、0.45±0.03、0.36±0.02、0.9±0.02, F=614.919, P<0.01)。当过表达circTGFBR2或高表达ELAVL1时, PTBP2与ELAVL1的相互作用减弱, 细胞EMT的标志基因E-cadherin表达低于对照组, Vimentin及ZMYM1表达高于对照组, Transwell检测细胞迁移高于对照组, 而当同时高表达ELAVL1及circTGFBR2时, 上述趋势会进一步增强(Vimentin分别为0.22±0.02、0.87±0.02、0.85±0.02、0.6±0.01, F=1 319.52, P<0.01;E-cadherin分别为0.93±0.02、0.76±0.02、0.43±0.02、0.27±0.01, F=1 108.46, P<0.01;ZMYM1分别为0.24±0.01、0.53±0.02、0.32±0.01、1.04±0.02, F=2 023.794, P<0.01)。结论 circTGFBR2通过调节PTBP2/ELAVL1激活SMAD2信号途径促进前列腺癌发生发展。