杜氏盐藻环盒子1相互作用蛋白的酵母双杂交法筛选

目的:构建杜氏盐藻环盒子1(RBX1)的酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-RBX1,筛选与RBX1相互作用的蛋白。方法:采用PCR技术扩增杜氏盐藻RBX1的开放阅读框,测序分析后插入酵母表达质粒,构建诱饵载体p GBKT7-RBX1。将酶切鉴定正确的诱饵载体用PEG/Li Ac法分别转化到酵母菌Y187和AH109中,通过表型筛选检测RBX1对酵母菌有无自激活和毒性作用。转化诱饵质粒的Y187与文库菌AH109杂交,待三叶草形状的合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆并测序。结果:成功构建了p GBKT7-RBX1,它对Y187和AH109两种酵母菌既无自激活又无毒性作用。杂交后筛选得到两个阳性克隆,阳性克隆1与莱茵衣藻和拟南芥中氧化还原酶铁硫蛋白亚基的同源性为38%和39%,阳性克隆2与莱茵衣藻中转化抑制剂蛋白的同源性为57%。结论:诱饵载体p GBKT7-RBX1可用于酵母双杂交。成功筛选得到两个阳性克隆,可能是与RBX1相互作用的蛋白。