环糊精葡糖基转移酶的酶学性质及转化特性

目的:通过对一种强碱性环糊精葡糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性研究,探索改进和提高环糊精生产效率的工艺。方法:从一株碱性土壤来源的新型产环糊精葡糖基转移酶的嗜碱性芽孢杆菌,运用乙醇沉淀、DEAE-Sepharose和HiTrap-Q离子交换柱层析等蛋白质分离纯化技术对该酶进行了纯化,测定了其酶学性质,并对其转化特性进行了研究。结果:经过微生物发酵和三步纯化,获得表观电泳纯的酶蛋白,纯化倍数为51.4,收率约9.2%。该酶的最适反应温度为50℃。酶的最适作用pH约为10,并且在pH6～pH12条件下均较稳定。用5%可溶淀粉作底物进行转化,转化率约40%。在转化过程中加入沉淀剂环己烷,产物中β-CD的比例从84%提高到95%。结论:该酶是迄今报道过的适宜pH最高的环糊精葡糖基转移酶,专一性转化生产β-CD的能力优良,具有工业化应用的潜力。

环糊精葡糖基转移酶法改性甜菊糖的研究

目的:优选环糊精葡糖基转移酶法对甜菊糖进行结构改变的工艺。方法:以甜菊苷酶改转移率为指标,通过对影响酶改性反应的pH、甜菊苷与淀粉的比例、反应温度、反应时间、酶的用量五个因素进行考察,首先确定pH以及甜菊苷与淀粉的比例对转化率的影响,对剩余三个因素采用正交设计考察,筛选了酶改性甜菊苷的最佳工艺。结果:最佳酶改工艺组合为:pH=6,淀粉与甜菊苷的比例为2∶1,反应温度40℃,反应时间24h,酶的用量为60u/g淀粉。结论:该方法能有效对甜菊苷进行酶改,工艺合理且操作简单。

浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶的克隆与表达

目的获取浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶基因并在大肠杆菌中表达。方法构建浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组菌株。经42℃诱导后,检测酶活性。结果浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶在大肠杆菌中成功表达,表达量达3 U/mL。结论浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶可以在大肠杆菌中高效表达。

重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。

嗜碱细菌环状糊精葡糖基转移酶的纯化和性质

嗜碱细菌52—2除去菌体的培养液经硫酸铵沉淀和DEAE－纤维素离子交换柱层析，得到凝胶电泳均一的环状糊精葡糖基转移酶，纯化了11.5倍，酶活力回收为5.7％。用浓度梯度PAGE测分子量为151700。酶反应最适温度为65℃，50℃以下比较稳定。酶反应最适pH为7．0，在6．0～9.0范围内稳定。Zn2+、Hg2+、Pb2+、Al3+、Cu2+、Ag+和Fe2+强烈抑制酶活力。紫外光谱在270nm和244nm处分别有最大和最小吸收。荧光光谱的最大激发波长和发射波长分别为283nm和335nm。用NBS、NEM、NAI、DEP和EDC对酶进行了化学修饰，初步推测组氨酸和色氨酸残基可能为酶活力必需基因，羧基与酶活力有一定关系。

β-环糊精葡萄糖基转移酶突变基因的表达及突变酶酶学性质分析

通过对已构建的β-CGTase质粒载体采用一步PCR法进行大片段基因的定点突变,得到三个带有突变位点的质粒载体,并将其进行转化得到突变菌株。分析突变酶的酶学性质并与β-环糊精葡萄糖基转移酶比较,结果表明突变酶酶活力提高到原酶活力的1.6倍以上,且突变酶作用的最适温度60℃、最适p H6.0、在60℃下和p H5~8范围内均非常稳定,经方差分析突变酶与原酶的酶学性质差异不显著（p〉0.05）,但是酶活力差异显著（p〈0.05）。

甜菊糖的酶法改性

甜菊糖是一种天然的强力甜味剂 ,它的二种组分———甜菊苷和甜菊双糖C苷有苦味和不愉快的后味 ,会显著影响甜菊糖的味质。通过酶改性法在甜菊苷、甜菊双糖C苷中引入一些糖基 ,可以改善甜质。目前酶改性甜菊糖的方法主要有 :环糊精葡糖基转移酶法、β -呋喃果糖苷酶法、半乳糖苷酶法和微生物糖基化法。本论文对这几种酶改性方法作一详细介绍。

改良甜菊苷不良味质生物酶的固定化研究

目的优选环糊精葡糖基转移酶的最佳固定化工艺,并对固定化酶的性质进行考察。方法以生物酶活力为指标,对影响生物酶活性的海藻酸钠、明胶、固定化酶液量、固定化时间、氯化钙及戊二醛进行了考查,并对固定化前后酶液的性质进行了比较。结果海藻酸钠浓度5%,明胶浓度4%,固定化酶液量占海藻酸钠、明胶总量的1%,固定化时间1h,氯化钙浓度5%,戊二醛浓度0.5%时固定化酶活力最强,固定化酶的适宜作用温度范围、pH值范围均比游离酶宽,固定化酶的热稳定性高于游离酶,重复使用时批次操作也显示出较好的稳定性。结论该方法简单、准确、可行,具有实用价值。

酶法改质甜菊糖的研究

研究环糊精葡糖基转移酶(CGTase)酶法改质甜菊糖的各种影响因素,确定适宜的反应条件,结果如下:甜菊糖浓度为15%,淀粉∶甜菊糖为2∶1,CGTase的添加量为0.3 mL,在65℃条件下反应30 h。