产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选育及酶分子改造研究进展

环糊精(cyclodextrin,CD)因其内疏水外亲水的特殊结构被广泛运用,而酶法制备CD是常用方法,主要应用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)。该文对产CGT酶的菌株选育和酶分子改造这两方面进行综述,重点讨论提升酶表达量的4种异源表达常用优化策略:产酶条件优化、信号肽选择、启动子优化、密码子优化,以及定点突变、定点饱和突变、易错PCR这3种常用的酶分子改造方法对酶相关特性的影响。

环糊精葡萄糖基转移酶my20结构域删除突变体的表达和酶学性能

本实验以海洋来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)my20为研究对象,构建了D、E以及DE结构域截短突变体,通过pET-24a载体和宿主菌E.coli BL21(DE3)进行异源表达,并利用镍亲和层析柱纯化得到纯酶。以my20环化比活力为100%计,my20ΔD、my20ΔE、my20ΔDE相对环化活力分别约为197%、22%、17%,表明E结构域是CGTase催化环化反应的重要结构域,D结构域的存在可能降低了底物分子进入催化结构域的能力。my20为耐热酶,3种截短突变酶相较之下耐热性均有不同程度的降低,说明D、E结构域在CGTase耐热性方面具有重要的作用。my20在缺失了DE结构域后,催化产物中α-环糊精占比相较其他截短酶提升约8%,表明缺失DE结构域影响其产物的特异性。本实验结果可为CGTase通过结构域改造在工业生产方面发挥作用提供一定的理论基础。

Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶Leu277突变提高α-环糊精产量

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)能够以淀粉为底物发生环化反应生成环糊精,包括α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)、β-环糊精及γ-环糊精,其中α-环糊精产量低且易降解。该研究选择Bacillus stearothermophilus NO2来源的CGTase,考察其突变体E142P、L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A以可溶性淀粉为底物生产α-CD的能力。与野生型相比,最优突变体为E142P/L277M,α-环糊精产量提高1.7 g/L,且在产物中占比提高14.3%。分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟结果表明,E142P/L277M突变体中2个突变位点相互影响较小。此外,L277M/N353A催化效果较差,MD结果表明该突变体整体结构变化较大且溶剂可及表面积增大,不利于转糖苷反应的发生。该研究为CGTase的分子改造提高环化反应活性以及CGTase在α-环糊精工业化生产中提升产量提供了新思路。

产环糊精葡萄糖基转移酶苦橙内生细菌的分离鉴定

为寻找产环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)的微生物新菌株,采用酚酞-甲基橙筛选平板、淀粉-碘筛选平板从苦橙内生细菌中分离获得一株可产环糊精葡萄糖基转移酶的新菌株,命名为KCEB04。形态学特征、生理生化反应、16S rDNA序列同源性分析结果表明,菌株KCEB04归属于产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。酶活测定结果表明,该菌株所产淀粉水解酶酶活为5 884.35 U/mL、α-CGTase酶活为1.65 U/mL、β-CGTase酶活为0.44 U/mL、γ-CGTase酶活为1.05 U/mL。

环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,V_(C))和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明:此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度37℃,底物比例3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到12.68 g/L;当糖基供体为麦芽糊精时,底物浓度为30 g/L,反应pH5.0,反应温度37℃,底物比例4/2,蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为30 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到4.96 g/L。在最适条件下,AA-2G的产量分别是未优化反应条件下的18.93倍和7.40倍。经动力学分析发现可溶性淀粉作为糖基供体的催化效率高于麦芽糊精,因此,可溶性淀粉作为糖基供体比麦芽糊精更具有优势,合成得到AA-2G的产量更高。本研究成功将重组CGTase-T1用于AA-2G的合成,通过优化酶法合成的反应条件,使AA-2G的产量得到了大幅提高,为实现AA-2G的工业生产提供参考意义。

环糊精葡萄糖基转移酶的生产及其分离纯化研究进展

环糊精因其特殊的性质而备受食品、化妆品和制药等行业的青睐。对环糊精的巨大需求也使其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase,EC2.4.1.19)成为人们关注的热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、菌株筛选等方面,从发酵生产到分离提纯的系统性报道并不多见,因此,结合国内外对CGTase的大量研究工作和中国的资源优势,笔者以CGTase的发酵生产和分离提纯为出发点,以环糊精产业未来的商业需求为基础,对优质CGTase的发酵生产和提纯方法进行了综述,同时对该领域的未来研究进行了展望。

β-环糊精葡萄糖基转移酶的固定化及其酶学性质

采用吸附-交联法对β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltranserase,β-CGTase)进行固定化,对吸附载体进行了比较和筛选,优化了交联条件,并对固定化后酶的催化特性进行了初步分析。研究表明阴离子交换树脂D380对β-CGTase的吸附性较好;固定化的最佳条件为:戊二醛浓度0.02%、pH 8.0、4℃和固定化8 h,固定化后β-CGTase的酶活可达842 U/g。固定化β-CGTase的热稳定性显著提高,具有良好的操作稳定性;与游离态相比,固定化β-CGTase催化瑞鲍迪苷A形成的产物较少,显现出更佳的催化特异性。

一株产CGTase环糊精葡萄糖基转移酶的细菌改性甜菊苷的研究

本文对筛选的一株产CGTase环糊精葡萄糖基转移酶的细菌(Bacillus sp.CGT7)转化并改性甜菊苷进行了研究,探讨了影响酶活性和转化效果的因素.实验结果表明,在CGT7菌的培养过程中,碳源、氮源、温度和初始pH等因素对菌株产酶活性均有不同程度的影响,适宜的碳源为马铃薯淀粉,氮源为豆粕粉,培养温度为30℃,初始pH值为8.5.适宜条件下培养的CGT7菌的酶活性可达544 U/mL,以甜菊糖苷为底物、环糊精为糖基供体时,转糖苷产物Stv-Glu浓度为0.61 mg/mL.

Bacillussp.HA-1产环糊精葡萄糖基转移酶发酵工艺研究

在10 L 发酵罐中,研究了环糊精葡萄糖基转移酶产生菌 Bacillus sp．HA-1的发酵规律,结果表明,在菌体对数增长期,发酵液溶氧处于较低状态,发酵液 pH 在对数增长前期持续下降,中期后回升,菌体产酶呈增长趋势；当菌体增长进入稳定期,发酵液溶氧迅速回升至初始状态,pH 也回升至起始值,菌体产酶接近峰值。根据发酵规律优化发酵工艺,通过有效增加菌体对数增长期发酵液溶氧,使菌株产酶到达高峰的时间缩短了 50%以上。应用该菌株在5 m^3生产罐中发酵,24 h 产酶水平达到6 800 IU/mL。

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶 (CGTase)产生菌 4 0 3,96h发酵酶活为 0 95U mL。经紫外辐射和硫酸二乙酯复合诱变而获得突变株CLS4 0 3,96h发酵酶活达 1 36U mL ,提高 4 3%。该突变菌株被鉴定为地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis) ,产CGTase的最佳碳源为可溶性淀粉 ,最佳氮源为硝酸铵 ,最适初始pH为 6 5 ,最适培养温度为 35℃ ,发酵期间CGTase的产生高峰 (第 96h)滞后于菌体生物量高峰 (第 4 8h) 2d。菌株所产CGTase的最适反应pH为 6 0 ,最适温度为 5 5℃ ,在pH 6 0～ 7 5间和 5 0℃下保持 1h后的剩余酶活均达 90 %以上 ;酶液中适量添加Ca2 + 能大幅提高CGTase在 5 5℃下的稳定性。经高效液相色谱分析 ,CGTase作用于淀粉后的产物以α 环糊精为主 ,β 环糊精为次 ,二者比例为 2 4 7∶1,环糊精总产率达 2 9 8% ,但产物中不含γ

环糊精系列综述之一 环糊精葡萄糖基转移酶的筛选及其定向改造

环糊精因其特殊性质得到了食品、化妆品、医药等行业的青睐,全球消费量逐年稳步增加。环糊精的巨大需求也使其生产中所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶,EC 2.4.1.19)成为研究热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、产物专一性机理等,鲜见从菌株筛选出发的系统性报道。因此,作者从野生CGT酶菌株的筛选出发,立足未来环糊精工业的商业诉求,综述了优质CGT酶获取的多种途径。同时结合国内外对CGT酶的大量研究工作以及我国的资源优势,对该领域未来的研究提出更高的期望。

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的芽孢杆菌Sx菌株，经16SrRNA测序分析，结合菌体及菌落的形态特征，鉴定该茵株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。对其产酶条件与酶学特性进行了研究。结果表明，以1g／dL玉米淀粉和2g／dL豆粕粉为碳氮源，pH6．5，30℃，220r／min，60h的条件下，菌株所产CGTase酶活性可达5596U／mL；该酶在30～50℃，pH5．5-9．0下保持稳定，在50℃，180r／min，PH6．5，CGTase酶活力为1107U／mL的条件下对20mg／mL甜菊甙转化48h，甜菊甙溶液中的莱鲍迪甙与甜菊甙的比值（RA／SS）从转化前的0．45上升到0．53。

β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株02-5-71的选育及发酵条件研究

应用氮离子注入对嗜碱芽孢杆菌进行诱变育种,获得了产生β-环糊精葡萄糖基转移酶是出发菌株2倍以上的高产菌株,酶活力可达6000U/mL以上.应用正交实验法筛选出最优发酵条件.

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b(+)中,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt,并将其转化表达宿主E.coliBL21(DE3)。对重组菌E.coliBL21/pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件:葡萄糖8 g/L,乳糖0.5 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母膏24 g/L,K2HPO472 mmol/L,KH2PO417 mmol/L,CaC l22.5 mmol/L;初始pH为7.0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90 h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22.1 U/mL,与来源菌P.macerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3 L发酵罐中发酵,90 h后胞外酶比活达到22.6 U/mL,证实了工业化放大的可能性。

嗜热芽胞杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽胞杆菌中的表达

【目的】构建分泌表达α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)的重组枯草芽胞杆菌,实现α-CGTase的安全高效表达。【方法】通过PCR法扩增嗜热地芽胞杆菌α-CGTase基因,运用EcoRI/XhoI分别对α-CGTase基因及pBES进行双酶切,然后将该基因片段插入到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭载体pBES中,再电转化法转化枯草芽胞杆菌RIK1285;对重组枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵条件进行探索。【结果】(1)利用发酵培养基分泌表达α-CGTase,重组枯草芽胞杆菌工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵上清液产酶达到2.9U·mL-1。(2)TB为最适发酵培养基(配方:甘油0.5%,蛋白胨1.2%,酵母粉2.4%,K2HPO41.64%,KH2PO40.23%);在初始pH6.5,温度为37℃下,摇瓶发酵培养24h后,α-环糊精酶的环化活性达到5.3U·mL-1,是野生菌株嗜热地芽胞杆菌(0.66U·mL-1)的8倍。【结论】成功构建了枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT工程菌,并确定其最适发酵培养基和培养条件。

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化,结果表明,当底物马铃薯淀粉浓度15%,反应初始pH5.5,温度30℃,加酶量10 U/g干淀粉,环己烷浓度2.5%-5%(V/V),转化周期24 h,β-环糊精转化率达到最高值75.3%,是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。

金属离子协同氨基酸提高重组β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达

随着环糊精的应用越来越广,其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19,简称CGT酶)已成为研究热点。为了克服天然菌种产环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)能力低等缺陷,该文将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶基因插入质粒p ST中,构建了分泌型表达载体cgt/p ST并在宿主B.subtilis WB600中成功表达;通过对摇瓶发酵产CGT酶的条件进行优化发现,当发酵培养基为TB,p H为7.0时,37℃培养48 h后胞外酶活力达到27.9 U/m L,与天然菌株B.circulans STB01在较优发酵条件下所分泌的胞外酶活力相比,提高了近19倍;对TB培养基碳源、氮源进一步优化,以6 g/L的玉米淀粉替代TB培养基中的甘油,以30 g/L的酵母提取物作为氮源,胞外酶活可达到31.2 U/m L;亮氨酸、天冬氨酸的添加能明显促进β-CGT酶的胞外表达,而0.5mmol/L Fe3+的添加能进一步将胞外酶活提高到36.9 U/m L。这是目前报道的β-CGT酶在B.subtilis中胞外表达的最高β-环化活力。

环糊精及环糊精葡萄糖基转移酶特性研究

环糊精以其独特的理化特性广泛应用于制药、食品、农业及化妆品等领域,环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是合成环糊精的关键酶。综述了环糊精葡萄糖基转移酶的筛选策略、CGTase的定位、催化机制、环糊精的生产过程及其在生产中的具体应用。

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75kDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km和Vmax值分别是50mg/ml和6.07mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+,Zn2+,Fe3+,Cu2+,Fe2+,Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为:酶量200μ/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。

响应面法优化多黏芽孢杆菌产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养基

为了提高多黏芽孢杆菌YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶的能力,对培养基条件进行优化,并利用优化后的培养基条件考察培养时间及不同初始p H对YLW-8产酶的影响。采用Plackett-Burman重要因素筛选实验筛选出影响产酶的3个主要因素:玉米淀粉、麸皮、磷酸氢二钾。在此基础上利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,最后利用中心组合实验确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,玉米淀粉1%,硫酸铵0.15%,麸皮1.5%,碳酸钙0.5%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾0.01%,酵母膏0.4%,硫酸镁0.015%时,α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活为3089.8U/m L,利用该培养基条件培养时间可缩短至3d,初始p H8.0。该条件可以降低染菌的几率,大大减少生产成本,可应用于α-环糊精生产工业。