环羟基化双加氧酶α亚基保守序列的克隆及基因定位

利用PCR法成功地克隆了不动杆菌(Acinetobacter)L2菌株的环羟基化双加氧酶α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序。序列分析结果表明该片段与3苯-基丙酸盐双加氧酶α亚基、苯1,2双-加氧酶α亚基、甲苯2,3双-加氧酶α亚基的氨基酸序列同源性分别为72%、75%和78%。Southern杂交将菌株L2的环羟基化双加氧酶α亚基基因定位在L2质粒的不同酶切片段上。

双液相体系下对黑根霉C_(11)α-羟基化16α,17α-环氧孕酮的研究

研究了双液相体系下黑根霉对16α,17α-环氧孕酮C11α-羟基化的生物转化能力.考察了8种有机溶剂对16α,17α-环氧孕酮和C11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的溶解度的差异,比较了它们对黑根霉细胞毒性的大小.结果表明,乙酸丁酯毒性最小,乙酸丁酯与水双液相体系对转化比较有利,达到了44.2%.同时考察了氧促进剂H2O2和外加电子受体维生素K3对提高该体系转化率的影响,分别提高了8%和6%.

双加氧酶α亚基保守序列克隆及探针制备

制备地高辛标记的环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列探针。利用PCR法成功地克隆了环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序。利用PCR法制备地高辛标记探针,对新标记的探针进行检测,结果显示其标记效率在0.1 pg/μL;敏感性检测表明,对同源DNA的检出限量为100 pg;对提取的副溶血性孤菌质粒DNA、短小芽胞杆菌总DNA杂交均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。

羟基化改性棉纤维基吸附剂的制备与性能研究

探讨羟基化改性棉纤维基吸附剂的制备工艺及性能。以棉纤维为基材,通过环氧氯丙烷和高碘酸钠对棉纤维进行环氧化和双醛氧化,然后通过环氧氯丙烷作交联剂接枝β⁃环糊精,利用缩醛反应接枝端羟基超支化聚合物。通过对重金属离子的吸附试验,得出的较优制备工艺为环氧化温度40℃,高碘酸钠质量分数0.6%,双醛氧化时间3.5 h。以0.4 mol/L的HCl为解吸剂、质量分数5%的NaOH为再生剂时,解吸⁃再生效率较高。认为:改性棉纤维基吸附剂对重金属离子的吸附能力比棉纤维更高,通过HCl解吸与NaOH再生后仍具备较高的吸附效果。

冶炼企业周边农田土壤的多环芳烃污染及其细菌群落效应

多环芳烃是一类持久性有机污染物,进入土壤后可能产生多方面生态效应。为研究多环芳烃对土壤微生物的影响,选取南京某冶炼企业周边农田样品,在分析污染物含量基础上,采用高通量测序、定量PCR等方法综合评价了土壤细菌多样性和组成以及多环芳烃降解细菌丰度等特征。17个土壤样品中,多环芳烃总量为0.25~31.08 mg·kg-1,并具有随污染源距离增加而降低的空间分布特征。与土壤理化性质如p H相比较,多环芳烃污染对土壤细菌的总体多样性和群落组成影响不显著。进一步分析发现多环芳烃与潜在降解微生物的相对丰度和降解功能基因(芳香环羟基化双加氧酶,PAH-RHDα)拷贝数显著正相关。污染较重样品的克隆、测序分析表明,土壤中PAH-RHDα基因主要属于革兰氏阳性细菌nid A3/fad A1类群,且与分支杆菌相关序列较为接近。这些结果综合评价了冶炼企业周边农田土壤多环芳烃污染对微生物群落的影响,提示土壤污染在多环芳烃潜在降解细菌中的富集作用,将为后续污染土壤生物修复提供重要科学依据。

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。

不同矮化砧木对苹果树体生长及矮化相关基因表达的影响

以砧木Y系和SH40实生后代及嫁接的红富士苹果为试材,探讨了不同砧木对树体生长及矮化相关基因表达的影响,以期为深入研究苹果砧木致矮机理提供理论依据。结果表明:Y-1和2号砧木上品种树高分别为乔化对照的51%和65.5%。Y-1砧木在6-8月份的GA20ox1基因表达强度均显著低于对照,其上嫁接的品种8月份表达强度显著低于对照。NCED1基因在6月份的表达强度显著高于对照,7-8月份的显著低于对照;其上嫁接的品种7月份的表达强度显著高于对照,而8月份的显著低于对照。在7-8月份2号砧木及嫁接品种GA20ox1基因和NCED1基因的表达强度均显著低于对照。

多氧取代环己基甲醇苯甲酸酯的合成及其表征

以莽草酸为原料,经酯化、丙酮叉保护顺式邻二羟基、叔丁基二甲基硅烷保护羟基、还原、羟基酯化、最后双羟基化反应,得到多氧取代环己基甲醇苯甲酸酯(1),总产率为84.1%,其结构经IR、1H NMR和HR MS确证。对双羟基化反应的条件进行了探索,优化条件为:反应时间为15h,溶剂为THF∶H2O=1∶1(V∶V),配料比为n[(3R,4R,5R)-5-叔丁基二甲基硅氧基-3,4-(丙酮叉二氧)-环己基-1-烯烃-1-甲醇苯甲酸酯(5)]∶n(N-甲基吗啉氮氧化物)∶n(OsO4)∶n(手性配体)=100∶150∶0.5∶1,产率为90.6%,e.e.值为75.1%。

植物中α-酮戊二酸/Fe(Ⅱ)依赖双加氧酶研究进展

酮戊二酸(2OG)/Fe(Ⅱ)依赖双加氧酶[2-oxoglutarate/Fe(Ⅱ)-dependent dioxygenases,2-ODD]广泛参与植物的多种代谢过程,是植物体内一种重要的氧化酶。它不仅对植物的生长发育具有重要意义,而且在许多药用植物活性成分的生物合成中扮演重要的角色。本文主要综述2-ODD参与的不同代谢反应,为深入研究2-ODD功能提供参考。

3-芳基-7-甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯类化合物的合成及杀菌活性

为了优化3-苯基-7-甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯的化学结构,通过环氧化-内酯化和Sharpless不对称双羟基化反应作为关键步骤,分别以61%~91%的收率实现了消旋及光活性3-芳基-7-甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯类化合物的合成,其结构经过IR,^(1)H NMR,^(13)C NMR和HR-ESI-MS的表征.对它们的杀菌活性进行了评价,结果表明(R)-3-苯基-7-甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯(5a)活性最好的化合物,对6种植物病原菌的EC_(50)值在0.2~13.5μg/mL范围,优于其(S)-异构体及消旋体混合物.它可以作为先导结构进行进一步结构优化.扫描电镜和透射电镜观测的结果显示,化合物(S)-5a,5d和5j对油菜菌核菌菌丝细胞的结构和功能有显著影响.

黄素依赖的单加氧酶催化酰胺键的Bayer-Villiger反应

黄素依赖的单加氧酶(flavin-dependent monooxygenases,FPMOs)在自然界广泛存在,是生命体合成代谢和分解代谢中不可或缺的一类关键酶.它们参与天然产物合成、生物质降解以及异质化合物解毒等生化过程[1-3].FPMOs利用还原型的黄素类辅因子活化O2,生成与辅因子共价连接的过氧物种,然后将其中一个氧原子插入到反应物中,另一个氧原子则通过还原生成水.这类酶催化的化学反应多样,包括羟基化、环氧化、环化、(去)卤化、(去)芳构化和Baeyer-Villiger氧化等[4].其中Baeyer-Villiger氧化是由酮合成酯的重要反应,通过在酮羰基与相邻C原子之间插入O原子而实现酮类化合物的酯化或者内酯化.目前有较多Baeyer-Villiger单加氧酶(Baeyer-Villiger monooxygenases,BVMOs)报道[5],他们都是黄素依赖的酶,以经典的FPMOs催化机制完成C—C键之间的插O反应,即黄素辅因子(flavin adenine dinucleotide,FAD或者flavin mononucleotide,FMN)首先在还原型辅酶I(reducedβ-nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)或者还原型辅酶II(reducedβ-nicotinamide adenine dinucleo-tide phosphate,NADPH)作用下得到还原性黄素(FADH2或者FMNH2).

3,7-二甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯类似物的合成及杀菌活性

以环氧化-内酯化和Sharpless不对称双羟基化反应作为关键步骤,以55%~90%的总收率实现了消旋及光活性3,7-二甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯类似物的合成.它们的结构经过^(1)H NMR,^(13)C NMR,HR-ESI-MS和X射线衍射的表征.对它们的杀菌活性进行了评价,结果表明活性最好的化合物3-苯基-7-甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯(4)和3-(呋喃-2-基)-7-甲基-7-羟基-2-辛烯-6-内酯(5)对6种植物病原菌的EC_(50)值为0.5-20.0μg/mL,可以作为先导结构进行进一步结构优化.

多环芳烃(PAHs)污染对滨海湿地入侵植物互花米草的影响

滨海湿地生态系统正遭受着人为活动或自然因素的威胁,为探究多环芳烃（PAHs）污染对滨海湿地入侵植物互花米草根际、根内微生物的影响及植物-微生物联合修复PAHs的潜力,设置含有不同浓度菲和芘的沉积物处理,通过盆栽实验对互花米草幼苗进行暴露.结果显示,培养70 d后,菲和芘的去除率分别为13%-36%和11%-30%;菲处理的互花米草根际沉积物中脱氢酶活性显著高于对照（P〈0.05）,非根际沉积物多酚氧化酶活性则降低10%.磷脂脂肪酸（PLFA）分析显示,菲处理显著降低了根际沉积物微生物量（P〈0.05）,尤其是革兰氏阴性菌下降了24%;而芘处理对脱氢酶、多酚氧化酶以及总微生物量的影响相对较小.100 mg/kg菲处理使得根际与根内革兰氏阴性菌PAHs-环羟基双加氧酶基因（PAH-RHDα-GN）丰度比对照组分别增加了100倍和3倍;而100 mg/kg芘处理使得根际与非根际沉积物中PAH-RHDα-GP丰度显著升高（P〈0.05）.上述结果表明,入侵植物互花米草对PAHs污染存在明显的响应,其根内细菌在植物-微生物联合修复PAHs污染具有重要的作用.